灯盏乙素是灯盏花的主要活性成分,对治疗心脑血管疾病疗效显著,与等剂量丹参素相比毒性较低,是一种应用前景广阔的药物。现代药理学研究表明,其具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化、抗炎和促进免疫调节等药理活性。随着利用合成生物学方法合成天然产物的技术迅速发展,运用代谢工程以及合成生物学的方法生产灯盏乙素是解决灯盏花资源短缺的有效手段。非常规酵母解脂耶氏酵母富含关键前体乙酰辅酶A、NADPH、ATP,具有独特的疏水环境,富含膜细胞和亚细胞腔,缺乏Crabtree效应,它在高糖或呼吸受限条件下不会产生乙醇适合高密度发酵等特性使其成为生产黄酮类化合物的极佳宿主,本研究结果如下:（1）构建了基因表达的必需元件启动子和终止子元件库、靶向不同整合位点的整合载体和敲除载体,使用CRISPR-Cas9系统通过基因敲入的方法实现灯盏乙素通路基因的无标记整合。（2）将灯盏乙素合成通路分成对香豆酸合成模块、柚皮素合成模块以及灯盏乙素合成模块实现模块化优化,首先通过组合筛选不同物种来源的4CL和CHS增加柚皮素产量,含有灯盏花来源的Eb4CL和EbCHS的工程菌YL4在含有1 mM对香豆酸的YNB培养基中摇瓶发酵培养96 h柚皮素产量为131.59mg/L,通过进一步整合EbFSⅡ、EbF6H、ATR2、EbF7GAT、EbUDPGDH得到工程菌YL5,其灯盏乙素的产量为15.11 mg/L,灯盏甲素的产量为53.63 mg/L。（3）在对香豆酸合成模块中,通过组合筛选不同物种来源的PAL和C4H,含有灯盏花来源的EbPAL和EbC4H的工程菌YL9中灯盏乙素的产量为21.60mg/L,灯盏甲素的产量为85.44 mg/L,进一步过表达DAHP合酶ARO4和分支酸变位酶ARO7的突变体、乙酰辅酶A合成酶（ACS）以及过氧化物酶体基质蛋白（PEX10）,但产量并没有进一步提升,表明前体（对香豆酸和丙二酰-CoA）在此阶段不是一个限制性步骤。（4）在灯盏乙素合成模块中,测试了不同物种来源的F6H以筛选高催化效率的F6H,结果显示,来自黄芩的Sbai CYP82D4表现出最佳催化活性,与灯盏花EbF6H相比,灯盏乙素产量从21.6 mg/L提高到37.8 mg/L。同时,灯盏乙素比例从20.18%提高到96.54%,副产品灯盏甲素从79.81%下降到3.46%。（5）进一步增加EbCHS、EbFSⅡ、Sbai CYP82D4和ATR2拷贝数得到了最终菌株YL25,其在摇瓶发酵中产生了94.79 mg/L灯盏乙素,表明增加下游基因拷贝数对于引导碳通量向灯盏乙素的合成至关重要。最后,通过优化发酵条件,在1.3 L生物反应器中灯盏乙素的产量提高了22.3倍,达到346 mg/L。本研究中灯盏乙素的产量是目前微生物中报道的最高产量,本实验结果为在非常规酵母上进一步生产天然产品奠定了坚实的基础,并具有工业生产的潜力。