研究背景:脓毒症是机体对感染反应失调而产生的危及生命的器官功能损害。脓毒症不仅发病率和病死率高,即使幸存,其再入院率和晚期病死率与非脓毒症患者相比明显增高,而复发性脓毒症是脓毒症幸存者再入院的最常见原因之一。复发性脓毒症（recurrent sepsis）是指脓毒症幸存者再次发生严重感染,导致脓毒症反复发作,其高发病率和高病死率极大地加重了医疗负担。由于免疫失衡是脓毒症发生发展的关键机制,复发性脓毒症的潜在机制可能与免疫系统功能障碍密切相关。但目前针对复发性脓毒症的免疫学特征及其潜在机制的研究尚属空白,免疫功能紊乱可能是其中的关键所在。研究目的:探索急性脓毒症和复发性脓毒症小鼠中,固有免疫和适应性免疫系统的免疫状态及抗感染免疫功能的差异,明确复发性脓毒症的免疫学特征及其潜在机制。研究方法:通过向小鼠腹腔内注射不同频次的LPS（Lipopolysaccharide,脂多糖）来构建AS（acute sepsis,急性脓毒症）和RS（recurrent sepsis,复发性脓毒症）小鼠模型,评估小鼠体重变化、生存率等一般情况,采用流式细胞术检测各组小鼠脾脏固有和适应性免疫细胞比例、数量及表面功能性标志物的改变,探索复发性脓毒症对小鼠免疫状态的影响。随后,我们在AS和RS小鼠模型的基础上,采用H1N1 PR8病毒株滴鼻来构造继发性病毒感染模型。使用病毒空斑实验检测各组小鼠肺部病毒滴度,对小鼠肺组织进行HE（Hematoxylin-eosin,苏木精-伊红）染色并按组织学评分标准对其肺部病理改变进行组织学评分,使用免疫组织化学染色来比较各组小鼠肺组织CD4和CD8的表达情况,采用LEGENDplex多因子检测法检测小鼠外周血炎症因子水平,多方面探索复发性脓毒症小鼠对继发性病毒感染的抗感染免疫功能的影响。在随后的机制探索中,我们通过磁珠分选的方法来获取RS小鼠中表型最为明显的免疫细胞,并对其进行转录组测序。将过滤、质检后的测序数据与小鼠参考基因组比对,寻找显著差异表达的基因,并对其进行GO和GSEA富集分析,明确差异表达基因的具体富集特征,并通过RT-q PCR和Western blotting实验进行验证,探索差异表达基因所行使的主要生物学功能。研究结果:在复发性脓毒症对小鼠免疫状态影响的研究中,我们发现RS小鼠CD4+T细胞比例、数量以及CD4+/CD8+T比例的下降更为显著;CD69作为免疫细胞早期活化的标志,其在CD4+T细胞表面的上调受损;CD28是活化T细胞的重要共刺激分子,其在CD4+T细胞表面的表达明显降低;CD4+T细胞表面的抑制性受体Tim-3（T-cell immunoglobulin mucin 3,T细胞免疫球蛋白黏蛋白3）和PD-1（programmed death-1,程序性死亡受体1）表达显著增加;Tregs（regulatory T cells,调节性T细胞）的比例和数量均增加,因而CD4+T细胞在RS小鼠中呈明显的耗竭表型。除这些T细胞及其亚群自身的改变外,RS小鼠抗原呈递细胞MHC-II（major histocompatibility complex class II,主要组织相容性复合体II类分子）的总表达量显著降低,提示抗原呈递细胞将抗原呈递给CD4+T细胞的能力受损,进一步加重了CD4+T细胞的耗竭状态。在复发性脓毒症小鼠对继发病毒感染的抗感染免疫功能影响的研究中,我们发现流感病毒感染的RS小鼠肺部病毒滴度明显升高,肺部炎性细胞浸润减少,肺部病理改变减轻,且其外周血促炎细胞因子TNF-α（tumor necrosis factor-α,肿瘤坏死因子-α）、IFN-γ（Interferonγ,γ-干扰素）、IL-6（Interleukin-6,白细胞介素-6）的水平明显降低,抗炎细胞因子IL-10（Interleukin-10,白细胞介素-10）的水平明显升高,表明流感病毒感染的RS小鼠清除病毒的炎症反应明显减弱,肺部病毒滴度升高。此外,我们还发现流感病毒感染的RS小鼠肺部CD4+T细胞浸润明显减少。因此,在流感病毒感染的RS小鼠中,肺部病毒滴度升高、肺部炎症和病理改变减轻、CD4+T细胞浸润减少、外周血促炎细胞因子下降、抗炎细胞因子升高,这些结果均提示流感病毒感染的RS小鼠由于CD4+T细胞耗竭,抗病毒免疫反应明显减弱。在对RS小鼠CD4+T细胞呈明显加重的耗竭表型的机制探索中,我们发现Con、AS、RS这三组小鼠CD4+T细胞的差异表达基因所富集的生物学过程与生物调节、代谢过程、免疫系统反应等密切相关。在基因集富集分析中,我们发现差异表达基因所富集的GO term大多与炎症、免疫有关,通过筛选其中有显著性差异且表达量较高的基因,我们发现Nlrp3和Casp4这两个基因在RS中显著上调,且在后续的RT-q PCR和Western blotting实验中验证了这一变化趋势。由于Nlrp3和Casp4均为细胞焦亡信号通路中的关键分子,我们的结果提示复发性脓毒症小鼠CD4+T细胞呈明显加重的耗竭表型可能与其更易发生细胞焦亡密切相关。结论:复发性脓毒症小鼠CD4+T细胞呈明显加重的耗竭表型,主要表现为CD4+T细胞数量减少、CD4+T细胞表面共刺激分子CD28表达下降、CD4+T细胞表面抑制性受体PD-1和Tim-3表达增加、Tregs数量增加。除这些CD4+T细胞自身的改变外,复发性脓毒症小鼠抗原呈递细胞MHC-II的总表达量明显降低,进一步加重了CD4+T细胞的耗竭状态。且由于CD4+T细胞耗竭,复发性脓毒症小鼠适应性免疫应答严重受损,不能有效诱导清除病毒的抗感染免疫反应,炎症反应减弱,病原体清除障碍。在进一步的机制探索中,我们发现Nlrp3和Casp4这两个细胞焦亡信号通路中的关键分子在复发性脓毒症小鼠的CD4+T细胞中显著上调,提示复发性脓毒症CD4+T细胞呈明显加重的耗竭表型可能与其更易发生细胞焦亡密切相关,这可能是导致复发性脓毒症的发病率及晚期病死率升高的重要原因。