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近年来生物成像技术在体内外研究中得到广泛应用。荧光成像是生物成像技术的一种,具备操作简便、成像效果直观等优势,在众多荧光成像介质中,荧光纳米粒子凭借其粒径小、荧光稳定性高、生物相容性好等优点,在示踪及载药方面中取得了一定研究成果。单一成像技术不足以提供准确的诊断信息,而双模态成像可以使单一成像技术得以互补,结合两种成像技术的优点,用于科研或临床研究。目前的双模态成像探针多采用纳米粒子为载体,结合两种成像介质,经过合成、修饰与组装等过程获得最终的双模态成像探针,然而复杂的制备过程往往会影响成像介质的性能及成像效果。因此发展一种简单且同时具有良好双模态成像功能的生物成像探针用于体内外成像分析具有重要意义。研究目的:通过简化合成方法,利用生物相容性纳米材料介孔硅纳米粒子,富集具备荧光及计算机断层扫描（computed tomography,CT）成像功能的金纳米团簇（Au nanoclusters,Au NCs）,从而同时提高成像介质的两种成像信号,构建高强度的荧光/CT双模态生物成像探针,用于细胞及体内成像研究。研究方法:第一部分:介孔硅富集金纳米团簇纳米粒子的构建及性能表征 通过一步法合成牛血清蛋白（bovine serum albumin,BSA）修饰的金纳米团簇（BSA-Au NCs）。采用紫外吸收光谱、透射电镜、电位粒度仪、三维荧光光谱等检测方法对BSA-Au NCs进行表征。以阳离子表面活性剂氯乙烯甲基苯丙胺（cetyltrimethylammonium ammonium chloride,CTAC）和三乙二醇（triethylene glycol alcohol,TEA）为模板,采用两相法合成介孔硅纳米粒子（mesoporous silica nanoparticles,MSNs）,并将其氨基化。通过EDC/NHS体系,将BSA-Au NCs富集于介孔硅表面,得到介孔硅富集金纳米团簇纳米粒子（MSN@Au NCs）。对富集纳米粒子进行透射电镜、Zeta电位、能谱分析等检测,以表征材料的理化性能,并证明材料的成功合成。第二部分:介孔硅富集金纳米团簇双模态生物成像探针的体外成像研究 通过电感耦合等离子体发射光谱仪（inductively coupled plasma optical emission spectrometer,IPC-OES）调整单纯的金纳米团簇和介孔硅富集金纳米团簇纳米粒子的浓度,使两者的金浓度相等,在此条件下,对两者的体外荧光成像性能及CT强度进行比较。利用分子荧光仪比较富集前后荧光强度的改变,测量荧光稳定性及荧光衰减情况。利用micro-CT测量两种纳米粒子的CT信号强度,比较CT成像能力。采用小鼠成纤维细胞系（L929细胞）、人舌鳞状细胞癌细胞系（CAL-27细胞及SCC-25细胞）以及腺样囊性癌细胞系（ACC-2细胞）,通过细胞毒性检测实验分析单纯的金纳米团簇及介孔硅纳米粒子富集后的MSN@Au NCs两种纳米材料的细胞毒性。将L929细胞和CAL-27细胞与上述两种纳米材料共同孵育,并在共聚焦显微镜以及双光子荧光显微镜下分别观察细胞摄取两种不同纳米材料后的荧光强度并进行半定量分析;利用流式细胞仪定量分析并比较细胞的平均荧光强度。第三部分:介孔硅富集金纳米团簇高强度荧光/CT双模态生物成像探针的体内成像研究 使用裸鼠进行双模态生物成像探针的体内研究,比较金纳米团簇与介孔硅富集金纳米团簇纳米粒子的活体双模态成像效果。首先通过尾静脉注射两种成像介质,一定时间后对实验裸鼠进行解剖,并取心脏、肝脏、脾脏、肺脏以及肾脏进行苏木精-伊红染色,在显微镜下观察各脏器的病理情况,分析两种成像介质的体内毒性。随后,在裸鼠皮下分别注射两种成像介质的水溶液,并使用小动物活体成像及CT成像设备对实验鼠注射了不同成像介质的部位进行荧光及CT成像分析,证明介孔硅富集金纳米团簇纳米粒子在荧光及CT双模态成像上的增强作用。研究结果:第一部分:介孔硅富集金纳米团簇纳米粒子的构建及性能表征 金纳米团簇:通过一步法合成的金纳米团簇,其紫外吸收光谱在280 nm左右波长处有一明显吸收峰,这是BSA的典型特征,证明了BSA的成功修饰;三维荧光光谱表征了金纳米团簇的激发波长和发射波长范围,结果提示合成的金纳米团簇可以发射近红外荧光并且具备大斯托克斯位移;从粒径仪及透射电镜检测结果可以观察到,BSA修饰的金纳米团簇粒径约为2 nm,呈球状。介孔硅纳米粒子:肉眼观介孔硅纳米粒子为白色胶状物,在水中溶解性较低、分散性良好,本身不能发光。透射电镜及粒径仪检测结果表明其呈球状、多孔结构,粒径在100 nm左右,可能发生团聚现象。介孔硅富集金纳米团簇纳米粒子:介孔硅纳米粒子富集金纳米团簇后,由不发光的白色胶状物变为可以发射红色荧光的略带棕黄色胶状物,且富集纳米粒子的电位、粒径以及元素组成均发生明显变化,证明富集材料的成功合成。第二部分:介孔硅富集金纳米团簇双模态生物成像探针的体外成像研究 从紫外光照射下的照片及荧光光谱可以看出,介孔硅富集金纳米团簇纳米粒子在金浓度相同的情况下表现出更高的荧光强度,其荧光寿命与单纯的金纳米团簇相比没有发生明显变化,说明富集过程并未影响成像介质的荧光性能。金纳米团簇及介孔硅富集金纳米团簇纳米粒子的荧光稳定性均优于普通荧光染料。Micro-CT检测结果表明,介孔硅富集金纳米团簇纳米粒子的CT信号增强,且随着浓度的提高亨氏单位（Hounsfield units,HU）数值呈线性升高。CCK-8检测结果表明,金纳米团簇及介孔硅富集金纳米团簇纳米粒子对L929细胞、CAL-27细胞、ACC-2细胞以及SCC-25细胞均无毒性,在较高浓度并共同培养48 h后细胞存活率均未出现明显下降。共聚焦显微镜及双光子显微镜观察,CAL-27细胞摄取介孔硅富集金纳米团簇纳米粒子后的荧光及双光子成像效果明显强于相同条件下细胞摄取单纯金纳米团簇的荧光及双光子成像效果。流式细胞实验定量分析进一步验证了上述结果,摄取MSN@Au NCs的CAL-27细胞平均荧光强度最高。第三部分:介孔硅富集金纳米团簇高强度荧光/CT双模态生物成像探针的体内成像研究 组织病理切片结果显示,注射金纳米团簇或介孔硅富集金纳米团簇纳米粒子水溶液后,裸鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏以及肾脏组织病理学表现均与对照组无明显差异,说明两种成像介质均不会对裸鼠的组织器官产生毒性作用,提示本实验构建的生物成像探针可应用于活体成像,具有良好的生物安全性。局部注射介孔硅富集金纳米团簇纳米粒子水溶液的裸鼠,其体内荧光及CT双模态成像效果优于单纯的金纳米团簇。活体成像结果表明,富集策略改善了金纳米团簇的荧光性能及CT信号强度,使成像介质的双模态成像效果得到显著提高。后续实验将对成像探针的性能加以完善,并探索其在疾病诊治中的作用。研究结论:1.金纳米团簇与生物相容性材料介孔硅纳米粒子通过静电吸附及羧胺键结合,使金纳米团簇富集于介孔硅孔径内,从而提高金纳米团簇局部浓度;2.利用金纳米团簇的大斯托克斯位移属性,富集后的成像介质,其荧光强度及CT信号强度均得到提高;3.本实验在无需复杂修饰及组装的前提下,构建了介孔硅富集金纳米团簇新型双模态生物成像探针,其生物安全性好、灵敏度高,细胞荧光成像效果明显优于单纯的金纳米团簇;4.富集策略改善了金纳米团簇的成像功能,基于介孔硅纳米粒子的双模态生物成像探针成功应用于体内成像,在裸鼠皮下表现出高强度的荧光及CT信号,或可作为高灵敏性的成像介质用于疾病的诊断和治疗。