氧化胁迫调控病原菌致病力的机制

来源 :中国科学院研究生院 中国科学院大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:lynneselina
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在病原菌与植物互作过程中,植物产生的活性氧(ROS)在降低病原菌致病力的过程中发挥了重要的作用。ROS能够激活植物的抗病防卫反应,抑制病原菌的生长或直接杀死病原菌。Pseudomonassyringaepv.tomatoDC3000(DC3000)是研究植物与病原菌互作的模式病原细菌,能够导致番茄细菌性斑点病。病原真菌Penicilliumexpansum广泛存在于自然界,能够造成多种果实的腐烂,产生的真菌毒素也威胁人们的健康。在DC3000和P.expansum侵染植物过程中,植物可以通过产生大量的ROS来抵御病原菌的感染。然而,ROS诱导的氧化胁迫降低DC3000和P.expansum致病力的机制尚不清楚。本研究通过膜蛋白质组学寻找对ROS敏感的DC3000膜蛋白,并选择其中有代表性的膜蛋白进行了_生物学功能的研究。同时,我们对硼引起的氧化胁迫降低P.expansum致病力的作用机制进行了探讨。研究结果将为揭示氧化胁迫调控病原菌致病力的分子机制提供新的证据。   1.首次建立了DC3000外膜和内膜蛋白质组学的研究方法:实验结果表明含有7M尿素、2M硫脲、1%(w/v)ASB-14、2mM三丁基膦(TBP)、40mMTris和0.5%(v/v)载体两性电解质(pH3-10)的外膜蛋白裂解液能够有效溶解DC3000外膜蛋白。其中,ASB-14和TBP具有重要作用。含有7M尿素、2M硫脲、1%(w/v)ASB-14、1%(w/v)β-DM、4%(w/v)CHAPS、50mMDTT和1%(v/v)载体两性电解质(pH3-10)的内膜蛋白裂解液能够有效溶解DC3000内膜蛋白,其中ASB-14、β-DM和CHAPS的使用具有关键作用。   2.研究了H2O2胁迫下DC3000生活力和总蛋白羰基化的变化,以及H2O2胁迫对外膜和内膜蛋白质组的影响:研究发现5mMH2O2显著降低了DC3000细胞的生活力并导致DC3000总蛋白羰基化程度提高,表明DC3000遭受了严重的氧化损伤,并暗示蛋白功能的改变可能与细胞生活力的降低有关。通过膜蛋白质组学研究了H2O2胁迫下来自DC3000外膜和内膜组分的蛋白的表达变化。总共鉴定到17个差异表达的来自外膜和内膜组分的蛋白。其中,11个蛋白属于转运蛋白,包括孔道蛋白(porins)和ABC转运蛋白等。氧化胁迫下,这些转运蛋白的表达均下调,表明转运蛋白对氧化胁迫敏感。   3.通过缺失突变体分析了转运蛋白PSPTO_1720和PSPTO_2152的生物学功能:利用三亲杂交和蔗糖负筛选,获得了PSPTO_1720和PSPTO_2152的缺失突变体。同时,构建了它们的互补和过表达菌株。结果显示,PSPTO_1720的突变导致DC3000对氧化胁迫更加敏感,而过表达PSPTO_1720使DC3000对氧化胁迫的抗性增加,表明转运蛋白PSPTO_1720参与了DC3000对氧化胁迫的防卫过程。PSPTO_2152的突变体和过表达菌株与野生型相比,对H2O2的敏感性没有显著差异,说明转运蛋白PSPTO_2152对氧化胁迫反应的作用不大。这些结果表明,氧化胁迫可能通过作用于特定的转运蛋白,降低DC3000细胞的生活力。   4.硼对P.expansum致病力的防治效果及抑制机理:硼对枣果实青霉菌的防治效果与使用浓度呈正相关。利用荧光探针罗丹明123发现硼处理后P.expansum的线粒体膜透势显著降低,说明硼能够作用于线粒体抑制这种病原菌的生长。由于硼能诱导氧化胁迫,推测氧化胁迫可能通过作用于线粒体来降低P.expansum的致病力。
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