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柑橘是世界第一大水果。现有巴西、中国、美国等138个国家(地区)种植柑橘,总面积1亿余亩,总产量1亿吨。我国柑橘栽培面积2700余万亩,年产量1800万吨,分列世界第一位和第二位。病虫为害是引起柑橘产量和品质下降的重要因素。在众多病虫害中,柑橘全爪螨Panonychus citri是影响柑橘生产最为重要的影响因素。该螨主要吸食柑橘叶片、嫩梢、花蕾和果实汁液,严重时引起落叶、落花、落果,造成减产。化学防治仍是控制柑橘全爪螨最有效的措施。但由于其个体小、世代多、繁殖力强,对药剂极易产生抗性。因此,有必要选择新的防治措施。通过植物介导RNAi技术获得抗性材料是控制害虫(螨)的新途径。几丁质酶广泛存在于微生物和动植物中,对昆虫脱皮、生长发育起着重要的作用,应用RNAi技术可影响昆虫(螨类)几丁质酶基因正常表达,从而干扰昆虫(螨类)正常的生长、发育及繁殖,而通过植物介导RNAi技术可以获得抗螨材料。本试验将几丁质酶PcCht2基因特异序列作为靶标序列,构建PcCht2基因的干扰载体,进一步采用农杆菌浸染转化柑橘,旨在获得对柑橘全爪螨有抗性的新材料。1柑橘全爪螨几丁质酶基因Unigene7021全长序列的扩增分析我们从柑橘全爪螨转录组数据库中筛选了13条几丁质酶基因,在NCBI上通过Blast检索对其序列进行比对分析,找出了一条保守性较高的基因即几丁质酶基因Unigene7021作为本研究的靶标基因。根据数据库中已知序列设计出5’-RACE和3’-RACE的扩增引物,用RACE试剂盒扩增出该基因5’-RACE和3’-RACE序列,用序列分析软件DNAMAN进行拼接分析,获得了柑橘全爪螨几丁质酶Unigene7021基因2518bp的全长序列,此序列的开放阅读框为1995bp,编码了665个氨基酸,采用DNAstar软件分析预测蛋白质的分子量约为239.94KDa,等电点为6.55。2RNAi载体的构建本研究选取了双元载体pFGC5941作为本研究的植物表达载体,对已克隆出的几丁质酶基因Unigene7021全长序列进行分析,找出其保守区域,并根据此区域设计出带有酶切位点的RNAi反向重复序列的引物,则通过RT-PCR扩增出的正向片段上含有XhoI和AscI两个酶切位点,反向片段上含有Xbal和BamHI两个酶切位点。将植物表达载体pFGC5941质粒和含有目标序列正向干扰片段的质粒同时双酶切,用T4连接酶将正向片段连接到该载体上,获得含有正向干扰片段的载体质粒ug7021XA-pFGC5941,然后将重组载体质粒与含有反向干扰片段的TA质粒同时双酶切,酶切产物用T4连接酶连接,成功地构建了含有反向重复序列的RNAi载体ug7021XA-pFGC5941-ug7021XB。3RNAi载体在柑橘中的转化通过电击法将重组载体质粒ug7021XA-pFGC5941-ug7021XB转化到农杆菌LBA4404感受态中,用锦橙上胚轴作为外植体,通过农杆菌侵染外植体的介导作用,将含有目标基因的重组载体质粒转化到外植体中,外植体在生长后获得一定数量的不定芽。用所设计的特异性引物对它们进行PCR检测,结果在10株不定芽中检测到了目标条带,即共获得了10株PCR阳性植株。