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研究背景和目的糖尿病是严重危害人们健康的常见病,糖尿病病人易并发心肌病或心衰,已成为糖尿病病人死亡的重要原因。然而,糖尿病心肌病的发生并不依赖冠心病及高血压的存在,它的发病机制也不十分清楚。近年研究显示,线粒体功能障碍与糖尿病心肌病密切相关。鉴于线粒体生物合成减少在糖尿病心肌线粒体功能障碍中的起始作用以及一氧化氮(NO)在线粒体生物合成中的重要调节作用,本研究先在2型糖尿病大鼠模型,揭示内源性一氧化氮合酶(NOS)抑制物非对称性二甲基精氨酸(ADMA)在糖尿病心肌线粒体生物合成障碍中的重要作用；再在培养的大鼠心肌细胞株(H9C2)细胞,研究ADMA对心肌细胞线粒体生物合成的直接作用；并从氧化应激、NO生成减少或活性降低两个方面,进一步探讨ADMA引起线粒体生物合成障碍的可能机制；同时研究抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸和NO合成的促进剂罗格列酮对ADMA抑制大鼠心肌细胞线粒体生物合成的影响,为阐明糖尿病心肌线粒体生物合成抑制机制以及糖尿病心肌病的临床防治提供新的实验依据。方法1.动物实验：采用给雄性SD大鼠高脂饲养加小剂量链脲佐菌素(STZ)腹腔注射的方法制备2型糖尿病大鼠模型；用RT-PCR方法检测大鼠心肌ADMA的主要代谢酶二甲基精氨酸-二甲胺水解酶(DDAH)基因的转录,用高效液相色谱测定大鼠血浆中ADMA浓度,用比色法检测大鼠心肌DDAH与NOS活性及NO代谢产物的含量以反映糖尿病大鼠心肌DDAH/ADMA/NOS/NO通路改变；检测线粒体基因细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COX I)与核基因β-actin拷贝数的比值以反映心肌线粒体生物合成；检测大鼠心肌ATP含量以反映线粒体功能；检测大鼠心肌组织抗氧化酶SOD活性以反映心肌抗氧化能力的改变；用RT-PCR方法检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活因子1α(PGC-1α)和解偶联蛋白2(UCP2)的mRNA水平以探讨2型糖尿病大鼠心肌线粒体生物合成抑制和ATP生成的可能机制。2.细胞实验：采用ADMA和高糖、高游离脂肪酸(油酸)孵育大鼠心肌细胞株(H9C2)细胞48 h,观察它们对大鼠心肌细胞线粒体生物合成的影响；采用RT-PCR检测PGC-1α基因和UCP2基因的转录水平,同时检测细胞NOS及SOD活性以及细胞培养基中NO代谢产物和脂质过氧化产物丙二醛(MDA)浓度；并选用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)、NO合成的促进剂罗格列酮(RSG)预孵育细胞12h,再与ADMA和高糖、高游离脂肪酸共同孵育细胞48 h,以探讨ADMA引起线粒体生物合成障碍的可能机制。结果1.动物实验：与正常对照大鼠相比,2型糖尿病大鼠血清中ADMA浓度明显升高；2型糖尿病大鼠心肌中ADMA的主要代谢酶DDAH1和DDAH2的基因转录显著上调,这可能是由于糖尿病大鼠心肌组织中内源性ADMA含量增加代偿性上调其代谢酶基因表达所致；糖尿病大鼠心肌DDAH与NOS活性以及NO含量与正常对照组比较均有明显降低。糖尿病大鼠心肌组织中抗氧化酶SOD活性也显著低于正常大鼠。与正常对照大鼠比较,糖尿病大鼠心肌COX I/β-actin比值明显降低,糖尿病大鼠心肌ATP含量也显著低于正常对照组,表明糖尿病大鼠心肌线粒体生物合成抑制,ATP生成减少。经相关分析显示,2型糖尿病大鼠血清内源性ADMA浓度升高与心肌线粒体生物合成抑制及线粒体ATP生成减少密切相关。进一步研究表明,导致糖尿病大鼠心肌线粒体生物合成抑制和线粒体ATP生成减少可能与心肌组织NO生成减少、PGC-1α基因转录下调、心肌抗氧化能力降低及UCP2基因转录上调有关。2.细胞实验：采用30μmol／LADMA处理心肌细胞48h可以明显降低心肌细胞线粒体DNA和ATP含量,并与高糖、高脂肪酸孵育作用相似,表明心肌线粒体生物合成抑制；同时ADMA和高糖、高脂肪酸孵育还下调PGC-1α基因转录、增加氧化应激、上调UCP2转录水平以及减少NO生成；分别用NAC和RSG治疗可以明显改善ADMA及高糖、高脂肪酸所致心肌线粒体生物合成抑制和ATP生成减少。结论本研究结果表明：①内源性NOS抑制物ADMA浓度升高与2型糖尿病大鼠心肌线粒体生物合成减少密切相关；②外源性ADMA孵育培养的大鼠心肌细胞可直接抑制细胞线粒体生物合成并减少ATP生成；③ADMA抑制糖尿病心肌线粒体生物合成及ATP生成可能与抑制NO生成、下调PGC-1α基因转录,增加氧化应激、上调UCP2转录有关。