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第一部分 非小细胞肺癌中miRNA-mRNA表达谱的生物信息学分析目的利用GEO公共数据库,选择miRNA表达芯片数据集,采用R语言工具处理数据,筛选出非小细胞肺癌患者与正常人差异miRNA以作后续研究。方法1、下载miRNA表达芯片数据集GSE17681和GSE29250采用R语言工具处理数据,筛选出非小细胞肺癌患者与正常人差异miRNA以作后续研究,通过Targetscan、starBase v2.0等数据库预测miRNA的靶基因。2、另选取mRNA表达芯片数据集GSE21933,处理数据后,筛选出差异mRNA,与预测的miRNA靶基因取交集,获得差异基因。3、利用生物信息学分析差异基因,确定影响非小细胞肺癌发生、发展的核心功能性基因,利用GO、KEGG等分析生物学功能、进程以及作用通路。结果1、GSE17681一共筛选出49个差异miRNA,其中上调miRNA为37个,下调miRNA为12个,GSE29250一共筛选出miRNA共计47个,其中27个miRNA过表达,20个miRNA低表达,将上调差异miRNA和下调差异miRNA分别取交集,获得共同差异miRNA为miR-1294,且结果显示在肿瘤组织中miR-1294表达下调。2、利用在线数据库预测miR-1294的靶基因,其中Targetscan7.2在线数据库预测得到3749个靶基因,starBase v2.0在线数据库预测得到2773个靶基因,二者有1466个共同靶基因。利用GEO数据库中GSE21933芯片分析得到NSCLC的差异mRNA,其中上调mRNA为1378个,下调mRNA为1513个。因为miRNA-1294在NSCLC肿瘤组织中表达降低,与其相关的mRNA应为上调mRNA,再与预测得到的mRNA取交集,得出miR-1294相关的差异mRNA共114个。3、对差异mRNA进行功能富集分析发现,生物过程集中在细胞循环、细胞内压力的改变、细胞乏氧、细胞分化的负性调节,还包括干细胞的分化、蛋白介导的线粒体膜的凋亡等。KEGG信号通路集中在癌症相关通路,包括胰腺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌通路等,还包括Hippo、p53、P13K-Akt等信号通路。4、利用String数据库对miR-1294靶向的mRNA构建PPI网络,通过CytoScape软件中的MODE插件分析,共筛选出关键基因有10个,包括VEGFA、CCNF、TPX2、MKI67、PRM2、YWHAG、UBE2N、CENPN、SLC2A1、TROAP基因。结论1、利用生物信息学分析方法筛选出NSCLC患者间的差异miR-1294作为目标miRNA用于后续研究。2、阐明了NSCLC肿瘤细胞中,miR-1294靶向mRNA的关键功能和信号通路,可作为NSCLC发生发展的关键基因。第二部分 miR-1294在NSCLC细胞系及NSCLC患者中的表达水平及临床意义目的通过临床相关病理实验数据验证生物信息学分析结果,明确miR-1294在NSCLC患者中的表达水平及临床意义。方法1、收集就诊于河南省人民医院NSCLC患者临床信息、术后肿瘤组织标本及癌旁正常组织样本。2、采用qPCR方法检测miR-1294在NSCLC肿瘤组织和癌旁正常组织中的差异表达情况,并在正常肺组织细胞系和三种NSCLC细胞系H1650,A549,95D中检测miR-1294的表达。3、结合NSCLC患者的临床信息,分析miR-1294表达水平与NSCLC患者临床特征及预后的关系。结果1、miR-1294在NSCLC患者肿瘤组织及肿瘤细胞系中低表达,且在A549细胞系中表达值最低,差异有统计学意义。2、miR-1294低表达与患者吸烟、淋巴结转移、TNM分期晚、肿瘤分化程度差有关。miRNA-1294低表达的患者总生存期相对较短。结论1、在NSCLC肿瘤细胞和组织中,miR-1294的表达水平显著下调。2、miR-1294在NSCLC的发生、发展过程中具有重要作用,可以作为NSCLC患者预后评估的一个可靠指标。第三部分miR-1294在肺腺癌细胞A549中的生物学功能研究目的研究miR-1294在肺腺癌细胞A549中的生物学功能。方法1、利用基因转染技术,将miR-1294mimics转染到NSCLC肿瘤细胞A549中,使miR-1294的表达水平上调。2、通过MTT细胞增殖实验及平板克隆实验方法检测细胞增殖能力,划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell小室实验检测细胞侵袭能力,以研究miR-1294是否在调控NSCLC细胞增殖、迁移、侵袭中起作用。3、流式细胞检测技术检测miR-1294是否在调控肺腺癌细胞系A549凋亡中起作用。4、建立荷瘤裸鼠模型,测量瘤体生长曲线,观察miR-1294 agomir转染细胞对荷瘤裸鼠生长的影响。结果1、过表达miR-1294显著抑制NSCLC肿瘤细胞A549的增殖、迁移和侵袭能力。2、过表达miR-1294可促进NSCLC肿瘤细胞A549的凋亡能力。3、移植瘤模型中,过表达miR-1294可抑制肿瘤体内生长。结论1、NSCLC细胞中miR-1294发挥了抑癌基因的作用。2、上调miR-1294可抑制NSCLC肿瘤细胞的癌性发展。第四部分 miR-1294抑制VEGFA调节肺腺癌细胞增殖、凋亡、侵袭目的研究miR-1294通过调节VEGFA对肺腺癌生物学功能的影响。方法1、双荧光素酶实验验证miR-1294与VEGFA的靶向关系。2、采用实时荧光定量PCR反应检测肿瘤组织及癌旁组织中VEGFA的含量,分析VEGFA与miR-1294的相关性。3、利用 Western blot检测转染miR-1294mimics和miR-1294inhibitors后细胞分泌VEGFA的变化。4、利用Western blot检测pcDNA-VEGFA质粒和miR-1294mimics共转染A549后VEGFA蛋白表达水平。5、利用MTT细胞增殖实验、流式分析技术及Transwell小室实验进一步验证VEGFA影响miR-1294对肺腺癌细胞的增殖、凋亡、侵袭作用。结果1、miR-1294 直接靶向VEGFA。2、肺腺癌患者中VEGFA表达上调,且与miR-1294表达负相关。3、过表达miR-1294的细胞中,VEGFA蛋白丰度下降;miR-1294表达抑制的细胞中,VEGFA蛋白丰度升高,差异有统计学意义。4、pcDNA-VEGFA质粒转染后能回补miR-1294mimics引起的VEGFA下调。5、细胞增殖、凋亡实验及细胞侵袭实验的结果表明,上调VEGFA蛋白水平可回补miR-1294对肿瘤细胞增殖、凋亡和侵袭的影响。结论1、miR-1294直接靶向VEGFA,与VEGFA表达负相关。2、miR-1294可调控VEGFA的表达水平,进而影响肺腺癌细胞的生物学功能。