论文部分内容阅读
颅骨锁骨发育不良（cleidocranial dysplasia,CCD）的患者,因为RUNX2基因（RUNT-related transcription factor2,又称成骨细胞特异性转录因子CBFα1）突变,导致牙齿迟萌或始终不能萌出于口腔。microRNA （miRNA）是近年的研究热点,为转录后水平的基因表达调控分子。本课题组前期研究提示RUNX2基因缺陷可能影响相关功能细胞的分化。但这种对细胞增殖分化的影响是否与miRNA有关?转录因子和miRNA之间往往可以通过相互作用来更精细准确地调节基因的表达,那么作为转录因子的RUNX2与miRNA是否有相互调控作用?本研究通过分析RUNX2与miRNA的相互调控,探讨RUNX2基因影响牙囊细胞生物学特性的miRNA相关的可能机制,试图为牙齿萌出障碍的研究提供新思路。本文内容共分为三部分：一、颅骨锁骨发育不全患者RUNX2基因突变检测目的：研究颅骨锁骨发育不全1例患者的RUNX2基因突变。方法：收集颅骨锁骨发育不全病例1例。患者来自广东省口腔医院牙周科门诊,男性,21岁,主诉为部分乳牙脱落后恒牙未萌,咬合不适,咀嚼无力,影响进食。首先对具有相关临床症状的患者详细采集病史,明确单发或家族聚集倾向；利用X线检查全面了解患者及其父母的全身骨骼发育情况；详细进行口腔专科检查,对其进行全身健康状况检查。结果显示该患者具有比较典型的CCD特殊面容,眼距增宽,鼻梁塌陷,额部圆突,颌面部小,面中部发育不足,侧貌为凹面形。口腔内表现为乳牙滞留,多数恒牙及多生牙埋伏于颌骨中,伴有锁骨发育不全,囟门闭合迟缓,第一指骨末端关节间隙变窄等等。临床特征符合颅骨锁骨发育不全（CCD）的诊断。患者的姐姐及双亲无异常,作为对照组进行研究。收集患者静脉血,提取全血基因组DNA,根据本课题组前期研究结果利用7对引物PCR扩增RUNX2基因7个外显子,双向直接测序,BLAST同源序列分析,检测基因突变位点。体外分离培养患者来源的牙囊细胞及正常对照牙囊细胞,进行Trizol法RNA提取,反转录获得cDNA,对cDNA测序验证基因突变。采用实时定量PCR （qRT-PCR）检测RUNX2mRNA表达水平的改变。结果：全血基因组测序结果发现,患者RUNX2基因第2外显子插入TG突变,导致下游多位点规则套峰,而正常对照组测序中未见这种改变。该突变导致第104位的谷氨酸GAG （W）移码突变为色氨酸TGG （W）,并在第144位提前产生TAG终止密码子,使RUNX2蛋白翻译中止,引起c端部分氨基酸丢失。牙囊细胞cDNA测序结果相同。该突变型为c.309310insTG。实时定量PCR结果显示,基因突变后RUNX2mRNA表达下调,但无统计学差异（P>0.05）。结论：本研究在CCD患者全血基因组DNA及牙囊细胞cDNA中均检测到RUNX2基因的相同突变位点,而家系中健康成员未发现此突变,进一步验证了RUNX2基因是CCD患者的致病基因。经搜索SNP数据库,未发现此突变位点的报告,证明本研究所检测到的为RUNX2基因新的突变位点,补充了国内外CCD致病基因的突变位点数据库。二、牙囊细胞中差异表达miRNA的筛选及靶基因预测目的：筛选RUNX2突变牙囊细胞和正常人牙囊细胞差异表达的miRNA并预测其靶基因。方法：首先从患者的下颌埋伏多生牙中分离了牙囊组织,实验组为颅骨锁骨发育不良患者（RWX2基因突变）埋伏恒牙的牙囊,恒牙上方没有滞留乳牙,无旋转、倒置等,牙囊完整。对照组为牙位、年龄、性别与实验组匹配的正常人埋伏恒牙牙囊。分离牙囊,磷酸盐缓冲液洗去血污,用眼科剪将组织剪成1-2mm3的小块,以低糖DMEM培养液用组织块贴壁法培养原代牙囊细胞（Human dental follicle cells, HDFCs）,3d后去除未贴壁组织,每3d换一次液,胰酶消化,1：3传代,显微镜下观察细胞形态,细胞免疫组化染色检测结果波形蛋白表达阳性,角蛋白表达阴性。收集第3至第5代牙囊细胞备用。取第5代对数生长期的RUNX2突变牙囊细胞（RUNX2+/m HDFCs）和正常牙囊细胞和（RUNX2+/+HDFCs）,吸干PBS后抽提Total RNA,经琼脂糖凝胶电泳条带分析鉴定RNA的质量,采用TaqMan（?） Array Human MicroRNA A+B芯片检测差异表达的miRNA,以Average Delta Ct值计算2-ΔΔCT相对定量分析RUNX2突变牙囊细胞和正常牙囊细胞样品相关miRNA转录本之间的表达差异。通过生物信息学方法使用miRNA靶标基因数据库miRGen预测差异表达的miRNA靶基因,通过DAVID功能注释进行靶基因功能富积分析。结果：RUNX2突变牙囊细胞较正常对照牙囊细胞,miRNA表达有显著差异。有69种miiRNA发生2倍以上表达上调（Fold change上调≥2）,54种miRNA发生2倍以上表达下调（Fold change下调≥2）。通过miRNA靶标预测工具分析发现,以上共123种miRNA中带有靶标基因的有41个,该41个miRNA的靶基因总和2718个,其中8个靶基因已有报道与牙齿萌出及成骨破骨分化相关。利用DAVID功能注释软件针对GO和KEGG Pathway分析2718个miRNA靶基因在何种功能及信号通路里富集。GO分析得到得到差异miRNA的靶标基因表达产物主要作用于细胞组分及功能、信号分子与受体结合功能等方面。而KEGG Pathway分析结果显示功能可能集中于癌症相关信号通路、MAPK信号通路等方面,因仅有4.6%-2.2%的相关靶基因富集于以上通路,故不列入继续讨论范围。结论：成功筛选出RUNX2突变牙囊细胞及正常对照牙囊细胞的miRNA表达谱,预测到部分靶基因。证实了RUNX2突变可能对相关miRNA的表达有影响。三、 miR-146a和miR-335在牙囊细胞的表达及miR-146a的功能分析目的：研究miR-146a和miR-335在RUNX2突变牙囊细胞和正常牙囊细胞中的表达差异,分析miR-146a的相关功能。方法：在上述差异表达的miRNA中,miR-146a和miR-335均有10倍以上的表达下调（miR-146a下调16.96倍,miR-335下调10.72倍）,靶基因预测结果部分相似,且文献报道这两种miRNA和RUNX2的表达或成骨分化相关,故选择miR-146a和miR-335进行进一步的研究。本部分首先利用miRNA原位杂交验证miR-146a和]miR-335在RUNX2+/m和RUNX2+/+牙囊细胞中的表达差异。将5’-DIG-标记的miR-146a和miR-335miRCURY探针滴加于第3代的RUNX2+/m HDFCs和RUNX2+/+HDFCs的细胞爬片上,观察阳性信号。在显微镜下对细胞爬片拍照后,进行灰度值半定量分析。之后,采用miR-146a mimic和miR-146a inhibitor（5’-FAM标记）转染第5代RUNX2+/+HDFCs.正常RUNX2+/+HDFCs作为对照组。转染后24h,收集牙囊细胞,提取RNA,进行实时定量PCR分析牙齿萌出及成骨破骨分化相关基因RUNX2, CSF-1,OPG的表达变化。结果：原位杂交结果显示miR-146a和miR-335在RUNX2+/m牙囊细胞中的表达水平均有下调,半定量分析结果有统计学差异（P<0.05）。该实验结果与microarray筛选结果具有一致性。可由此推断miR-146a和miR-335的表达水平变化与RUNX2突变相关。实时定量PCR结果显示miR-146a过表达后,RUNX2, CSF-1, OPG等基因表达下调。其中RUNX2和CSF-1的相对表达量在三组间（miR-146a mimic组,对照组以及miR-146a inhibitor组）均有统计学差异（P<0.05）,而OPG虽在miR-146a过表达时有下降趋势,在miR-146a inhibitor和对照组间有统计学差异（P<0.05）,但在miR-146a mimic和对照组之间无统计学差异（P>0.05）。结论：RUNX2突变影响了miR-146a和miR-335的表达,而过表达miR-146a又会下调RUNX2,CSF-1和DPG,RUNX2和相关miRNA之间可能存在相互调控网络。本研究表明,RUNX2突变影响了miRNA的表达,而RUNX2与miRNA之间的相互调控可能是RUNX2基因影响牙囊细胞生物学特性的关键机制。