金针菇是一种深受人们喜爱的食用菌,富含糖类、蛋白质、膳食纤维和矿物质等营养物质。近些年来,已经有大量文献报道从金针菇中分离得到的蛋白质和多糖具有抗病毒、抗肿瘤、调节免疫和保护肝脏等多种多样的活性功能。除此之外,黄酮、萜类、脂肪酸、甾醇以及核苷等小分子物质也被从中发现。目前关于这些小分子物质的生物活性报道主要集中在抗菌、抗氧化方面。麦角甾醇是金针菇所含甾醇类成分的主要成分之一,具有确切的抗肿瘤效果。然而,作为一种植物甾醇,麦角甾醇极难溶于水,在体内的吸收率很低。粗脂肪约占金针菇干重的9%,主要是指脂肪酸和甾醇。目前从金针菇脂质类物质中筛选出抗肿瘤活性成分,并研究提高生物利用度的工作还未见报道。肿瘤是现今危害人类健康最严重的疾病之一,世界各国的专家学者都在积极研究寻找治疗肿瘤的方法和药物。本文通过一种新型酪氨酸激酶受体抑制剂的高通量筛选模型——脂筏色谱,首次从金针菇中筛选出具有抗肿瘤活性的物质群——石油醚萃取物和乙醚萃取物。进一步研究表明,该物质群主要由脂肪酸和甾醇组成。体外肿瘤细胞抑制增殖实验证明二者具有良好的抑瘤活性。然而甾醇的水溶性很差,有必要改善其溶解度和生物利用度。纳米给药系统是提高难溶性药物溶解度和生物利用度的有效途径之一,本文制备了三种金针菇甾醇纳米制剂,通过不同给药途径,对纳米制剂在大鼠体内的药物动力学、小鼠体内的组织分布进行了初步研究。研究结果显示,纳米制剂能够提高甾醇的溶解度和生物利用度。上述研究结果为甾醇的新药开发提供了科学依据。全文主要研究工作如下：1、根据酪氨酸激酶受体抑制剂的高通量筛选模型——脂筏色谱,我们发现金针菇中甾醇和脂肪酸提取物具有抗肿瘤活性。采用MTT法测定两种提取物对体外培养人肝癌细胞HepG2、胶质瘤细胞U251、胃腺癌细胞SGC、肺腺癌细胞A549、宫颈癌细胞HeLa、结肠癌细胞Lovo增殖的抑制作用。应用气相色谱质谱联用仪(GC-MS)分析两种提取物的化学成分,利用高效液相色谱法(HPLC)分离制备甾醇物中的含量较高的两个主要成分,并鉴定它们的化合物结构。研究结果显示：金针菇甾醇和脂肪酸提取物对HepG2、SGC、U251、A549四种肿瘤细胞有较强的抑制作用,甾醇体外抑制HepG2、SGC、U251和A549增殖的IC50为9.29、11.99、23.85和20.44μg·mL-1,脂肪酸体外抑制SGC增殖的IC50为69.91μg·mL-1,对Lovo二种肿瘤细胞抑制作用较弱。甾醇提取物含有麦角甾醇,22,23-二氢麦角甾醇,Ergosta-5,8,22-triene-3-ol以及Ergost-8(14)-ene-3β-ol等四种成分；脂肪酸提取物含有19种成分,主要是十六烷酸,9-十八碳烯酸,9,12-十八碳二烯酸,9,12,15-十八碳三烯酸。2、首次建立起RP-HPLC(?)(?)同时测定金针菇子实体中麦角甾醇和22,23-二氢麦角甾醇的含量。色谱柱为Inertsil ODS-SP (250 mm x 4.6 mm,5μm),流动相为98%甲醇,流速1.0 mL·min-1,检测波长282 nm。麦角甾醇和22,23-二氢麦角甾醇在0.582～72.768μg·ml-1和0.586～73.248μg·m1-1范围内呈良好的线性关系。经测定,烘干后的金针菇子实体中麦角甾醇和22,23-二氢麦角甾醇的含量为0.30%和0.072%。3、为了改善金针菇甾醇的水溶性,我们运用纳米技术制备了金针菇甾醇微乳、脂质体和纳米胶束三种纳米制剂,并对其基本性质进行了考察。微乳为水包油型,平均粒径为22.9 nm,多分散性指数为0.310,包封率为(81.1±1.2)%。脂质体的平均粒径为108 nm,多分散性指数为0.151,包封率为(71.3±0.1)%。纳米胶束的平均粒径为115.6 nm,多分散性指数为0.029,包封率为(76.6±0.2)%。所制备的三种纳米制剂粒径小,包封率较高。4、首次建立起HPLC法同时测定鼠血浆样品、组织样品和粪便样品中麦角甾醇和22,23-二氢麦角甾醇两种物质含量的体内分析方法,并对定量分析方法进行了验证。色谱柱为Inertsil ODS-SP (250 mm×4.6 mm×5血浆、心、肝、脾、肺、肾、脑和粪便样品的流动相为96%甲醇溶液,胃样品的流动相为93%甲醇溶液,流速1.0mL·min-’,紫外检测波长282 nm,检测灵敏渡0.02 AUFS。所建立的分析方法专属性强,回收率、精密度以及冷冻稳定性等指标符合体内药物分析要求。5、以金针菇甾醇原药为对照,通过不同给药途径分别给予大鼠三种金针菇甾醇纳米制剂,同时测定麦角甾醇和22,23-二氢麦角甾醇在血浆中的浓度,研究金针茹甾醇纳米制剂在大鼠体内的药物动力学。(1)相比金针菇甾醇原药,口服给药后,微乳组、脂质体组和纳米胶束组中麦角甾醇和22,23-二氢麦角甾醇的AUC0-24分别提高了2.6、1.6和1.5倍,以及4.5、2.5和2.8倍。(2)相比金针菇甾醇原药,腹腔注射后,微乳组、脂质体组和纳米胶束组中麦角甾醇的AUC0-24提高了47.5、4.3和8.4倍,22,23-二氢麦角甾醇的AUC0-24分别为14.46、1.47和2.11μg·h·mL-1,原药组中的22,23-二氢麦角甾醇在血液中未被检测到。(3)尾静脉注射后,微乳组、脂质体组和纳米胶束组中的麦角甾醇在血浆中的消除半衰期t1/2分别为0.75、0.86和0.72h, AUC0-10分别为101.16、91.83和124.10μg·h·mL-1,22,23-二氢麦角甾醇的t1/2分别为0.85、0.85和0.75 h, AUC0-10分别为50.60、43.22和56.16μg·h·mL-1。由于甾醇原药以微粒混悬液形式给药,以至于原药组的静脉注射血药浓度未能得到。药动学研究结果表明,纳米制剂提高了甾醇在大鼠体内的生物利用度。6.以金针菇甾醇原药为对照,通过不同给药途径分别给予小鼠三种金针菇甾醇纳米制剂,同时测定麦角甾醇和22,23-二氢麦角甾醇在组织和粪便中的浓度,研究金针菇甾醇纳米制剂在小鼠体内的分布情况。(1)口服给药1h后,纳米制剂的药物能分布到大部分组织中,主要是在血流充足的肝、脾、肺和肾等组织。由于原药吸收缓慢,原药组1h在各脏器中均未检出药物。各组的药物在心脏和脑组织中分布很少或没有分布。由于药物口服吸收的tmax在5～8h,因此各组的药物浓度普遍很低。在4h时,纳米胶束组和原药组有大量的药物随粪便排出。(2)腹腔注射给药1h后,除了心脏和脑组织,纳米制剂的药物能分布到其余组织中。脂质体组和纳米胶束组的药物在肝脏中分布最多,其次是脾、肺、肾以及胃。与前两组相比,微乳组在各组织中的含量不高,这可能与微乳组腹腔注射的tmax最大有关。由于甾醇不溶于水,原药组几乎只能通过淋巴途径吸收,因而在组织中的含量很低,在粪便中的含量很高。(3)尾静脉注射给药1h后,纳米制剂因具有被动靶向性,药物在肝脏中分布最多,其次是肺、肾等组织。原药组在肾脏中的含量最高。组织分布研究说明甾醇制成纳米制剂后,药物在体内肝、脾、肺等脏器中的积蓄增加。