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研究目的本实验通过多标记免疫荧光技术和新的计算机成像技术来检测胰腺导管腺癌、胰腺腺鳞癌以及胰腺神经内分泌肿瘤患者肿瘤组织中6个不同标志物(CD4、CD8、CD31、FOXP3、cytokeratin(CK)、α-SMA)以及细胞核染料DAPI的分布和表达情况,对淋巴细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞等不同类型的细胞数量以及空间分布进行分析,目的在于研究不同肿瘤中的多种细胞的数量、空间分布的差异以及对肿瘤进展的影响。研究方法1.建立人肿瘤样本多标记免疫荧光分析平台。2.选取经外科手术切除的5例胰腺导管腺癌、5例胰腺腺鳞癌和5例胰腺神经内分泌肿瘤样本,所有的胰腺肿瘤样本经福尔马林组织固定液固定、石蜡包埋、切片后进行多标记复染。单独对CD4和CD8的免疫荧光进行分析,对不同肿瘤类型的CD4+T细胞、CD8+T细胞的数量和空间分布进行评估,并通过多通道流式细胞术进一步证明CD4+T细胞和CD8+T细胞的数量差异。3.使用上述5例胰腺导管腺癌、5例胰腺腺鳞癌和5例胰腺神经内分泌肿瘤样本,所有的胰腺肿瘤样本经上述实验处理后进行多标记复染。单独对FOXP3的免疫荧光进行分析,对不同肿瘤类型的CD4+FOXP3+Treg细胞的数量和空间分布进行评估。4.使用上述5例胰腺导管腺癌、5例胰腺腺鳞癌和5例胰腺神经内分泌肿瘤样本,所有的胰腺肿瘤样本经上述实验处理后进行多标记复染。分析CK+的肿瘤细胞中FOXP3的表达量和空间分布差异,对不同肿瘤类型的癌上皮细胞表达中FOXP3的表达和FOXP3+的癌上皮细胞的空间分布进行评估。5.使用上述5例胰腺导管腺癌、5例胰腺腺鳞癌和5例胰腺神经内分泌肿瘤样本,所有的胰腺肿瘤样本经上述实验处理后进行多标记复染。单独对α-SMA的免疫荧光进行分析,对不同肿瘤类型的成纤维细胞的数量和空间分布进行评估,从而分析不同肿瘤类型中组织纤维化的差异。6.使用上述5例胰腺导管腺癌、5例胰腺腺鳞癌和5例胰腺神经内分泌肿瘤样本,所有的胰腺肿瘤样本经上述实验处理后进行多标记复染。单独对CD31的免疫荧光进行分析,对不同肿瘤类型的血管内皮细胞的数量和空间分布进行评估,从而分析不同肿瘤类型中肿瘤微血管生成的差异。7.使用上述5例胰腺导管腺癌、5例胰腺腺鳞癌和5例胰腺神经内分泌肿瘤样本,所有的胰腺肿瘤样本经上述实验处理后进行多标记复染。分析不同肿瘤组织纤维化与CD4+T细胞、CD8+T细胞的浸润比例之间的相关性。8.使用上述5例胰腺导管腺癌、5例胰腺腺鳞癌和5例胰腺神经内分泌肿瘤样本,所有的胰腺肿瘤样本经上述实验处理后进行多标记复染。分析不同肿瘤微血管形成与CD4+T细胞、CD8+T细胞的浸润比例之间的相关性分析。结果1.我们建立了新的胰腺癌多重免疫标记平台,利用这个多标记复染方案,我们可以同时对组织石蜡切片中的六个不同标志物进行表达量和空间分布的评估。2.我们利用多标记复染方案分析不同类型胰腺肿瘤中多个生物标志物的表达和空间分布,我们通过CD4和CD8的免疫荧光,对不同肿瘤类型的CD4+T细胞,CD8+T细胞的数量和空间分布进行评估,并通过多通道流式细胞术进一步证明CD4+T细胞和CD8+T细胞的数量差异。我们发现胰腺导管腺癌和胰腺腺鳞癌存在显著高比例的CD4+T细胞而胰腺神经内分泌肿瘤中CD4+T细胞数量显著减少。胰腺导管腺癌存在显著高比例的CD8+杀伤性T细胞而胰腺腺鳞癌和胰腺神经内分泌肿瘤中CD8+T细胞数量显著减少。3.我们通过CD4和FOXP3进行多标记免疫荧光,对不同肿瘤类型的CD4+FOXP3+调节性T细胞的数量和空间分布进行评估。CD4+FOXP3+Treg细胞的浸润比例在胰腺腺鳞癌中显著升高,相反CD4+FOXP3-Teff细胞的比例显著降低。同时胰腺导管腺癌中也存在大量的调节性T细胞的浸润,但是在胰腺神经内分泌肿瘤中调节性T细胞的数量明显下降。4.我们通过CK和FOXP3进行多标记免疫荧光,对不同肿瘤类型的CK+的肿瘤上皮细胞的数量和空间分布进行评估。胰腺腺鳞癌中存在大量的CK+FOXP3+的肿瘤上皮细胞。在胰腺导管腺癌和神经内分泌肿瘤中CK+FOXP3+的肿瘤上皮细胞的比例没有显著差异。5.α-SMA+的肿瘤相关成纤维细胞与结缔组织增生及纤维化相关,我们发现胰腺腺鳞癌组织的纤维化程度明显高于胰腺导管腺癌和胰腺神经内分泌肿瘤。6.CD31高度表达于肿瘤微血管内皮细胞,是监控肿瘤微血管密度的重要指标。免疫荧光分析发现胰腺腺鳞癌有更多的CD31+血管内皮细胞存在,表明胰腺腺鳞癌存在更多的肿瘤微血管生成。7.应用免疫荧光检测三种胰腺肿瘤组织中,α-SMA+肿瘤相关的成纤维细胞与CD4+T细胞及CD8+T细胞浸润比例的相关性。分析发现胰腺肿瘤组织纤维化程度与CD4+T细胞及CD8+T细胞浸润之间无明显相关关系。8.应用免疫组化检测三种胰腺肿瘤组织中,CD31+肿瘤微环境内的血管内皮细胞与CD4+T细胞及CD8+T细胞的浸润的比例的相关性。分析发现胰腺肿瘤组织微血管生成和CD4+T细胞及CD8+T细胞浸润之间无明显相关关系。结论多标记免疫荧光分析了胰腺导管腺癌、胰腺腺鳞癌和胰腺神经内分泌肿瘤中CD4、CD8、CD31、FOXP3、CK、α-SMA不同的6个生物标志物的表达。分析发现作为恶性程度最高的胰腺腺鳞癌有更少的CD8+杀伤性T细胞浸润和更多的免疫抑制性调节性T淋巴细胞浸润,这预示着胰腺腺鳞癌肿瘤微环境中有更强的免疫抑制作用。胰腺腺鳞癌肿瘤细胞可以通过上调转录因子FOXP3的表达,直接抑制抗肿瘤免疫反应。同时腺鳞癌组织中存在大量的肿瘤相关成纤维细胞和微血管,意味着胰腺腺鳞癌有更高的组织纤维化和肿瘤微血管形成,这预示着胰腺腺鳞癌组织有更严重的组织纤维化和更强肿瘤转移能力。同时这三种胰腺肿瘤的纤维化程度以及肿瘤微血管生成与淋巴细胞浸润之间不存在显著的相关性。