论文部分内容阅读
目的:环状RNA（CircularRNA,circRNA）是一种独特的闭合圆环结构的非编码RNA（Non-coding RNA,nc RNA）,虽然已经证实许多人类疾病与circRNA有密不可分的联系,但circRNA是否对骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMMSCs）成骨分化过程具有潜在的调节功能有待进一步研究。本研究应用高通量测序技术（High-throughput RNA sequencing,RNA-seq）检测在大鼠骨髓间充质干细胞（Rat bone marrow mesenchymal stem cells,rBMMSCs）成骨分化过程中所有差异表达的circRNA和信使RNA（MessengerRNA,mRNA）;运用基因本体论（Gene ontology,GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）富集分析明显差异表达的circRNA和mRNA的潜在功能;结合生信分析的结果构建竞争性内源RNA（Competing endogenous RNA,ce RNA）调控网络;实时定量逆转录-聚合酶链反应（Reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction,q RT-PCR）验证高通量测序结果的准确性,并筛选出可能调控rBMMSCs成骨分化的circRNA-miRNA-mRNA调控轴;在分子水平和细胞功能水平鉴别circRNA驱动rBMMSCs成骨分化的关键分子及其信号通路;最后通过构建大鼠骨缺损模型验证circRNA在体内对骨修复重建的作用,本研究可为circRNA未来应用在骨组织工程提供参考依据和理论基础。方法:第一部分:收集足量的SD大鼠骨髓间充质干细胞,通过高通量测序技术获得rBMMSCs成骨分化过程中全部差异表达的circRNA及mRNA,再根据筛选标准（|Fold Chang|≥2.0,p＜0.05）,挑选出明显差异表达的circRNA及mRNA;探索差异表达的circRNA和mRNA富集分析条目中可能调控rBMMSCs成骨分化的信号通路,并利用生物信息学分析构建ce RNA调控网络;通过q RT-PCR方法验证测序结果中差异表达的circRNA和mRNA的准确性;最终确定需要进一步验证可能对rBMMSCs成骨分化具有潜在调控功能的circRNA-miRNA-mRNA调控轴。第二部分:综合生物信息学分析技术,结合q RT-PCR的验证结果,筛选出可能与rBMMSCs成骨相关的circRNA＿1809/miR-370-3p/Kitlg调节通路;利用RNA干扰（RNA interference,RNAi）手段构建沉默circRNA＿1809（si-circRNA＿1809）和miR-370-3p过表达/沉默（miR-370-3p mimics/miR-370-3p inhibitor）载体转染rBMMSCs,应用q RT-PCR、蛋白质免疫印迹、茜素红染色和Von Kossa染色方法,分析并探索circRNA＿1809和miR-370-3p对rBMMSCs成骨分化能力的影响;通过荧光素酶报告检测miR-370-3p和circRNA＿1809的交互关系;最后将敲低的circRNA＿1809结合miR-370-3p敲低/过表达转染rBMMSCs,检测对下游靶基因干细胞因子（Kitlg/SCF）的调节作用,分析影响rBMMSCs成骨分化的作用机制。第三部分:构建SD大鼠股骨骨缺损动物模型,将敲低的circRNA＿1809结合rBMMSCs回植大鼠骨缺损处,通过苏木素-伊红（Hematoxylin and eosin,HE）染色、X-ray、微型计算机断层扫描（Micro computed tomography,Micro-CT）和细胞免疫组化等一系列检测方法,评价大鼠股骨缺损区骨密度（Bone mineral density,BMD）、骨体积分数和成骨细胞特异性转录因子（Osterix,OSX）、骨桥蛋白（Osteopontin,OPN）等成骨指标的变化,体内验证circRNA＿1809对大鼠骨组织修复重建的调控作用。结果:第一部分:成功分离、培养rBMMSCs,免疫荧光染色技术和流式细胞术检测细胞表面抗原CD90、CD105和CD29呈阳性,CD45呈阴性,符合rBMMSCs的表面抗原特性;高通量测序检测发现共有29个明显差异表达的circRNA和2453个明显差异表达的mRNA;从差异表达的circRNA中筛选出10个差异表达最明显的circRNA,结合生信预测结果和高通量测序结果构建了ce RNA调控网络;最后选取10个差异表达circRNA和10个mRNA,通过q RT-PCR方法验证它们在成骨过程中表达量的变化,q RT-PCR结果表现出与测序结果相同的变化趋势,证明测序结果准确可靠;同时q RT-PCR结果显示circRNA＿1809和Kitlg分别是rBMMSCs成骨分化期间差异表达最明显的circRNA和mRNA。第二部分:生信分析技术预测circRNA＿1809/miR-370-3p/Kitlg轴可能参与调控rBMMSCs的成骨分化过程。q RT-PCR结果显示:rBMMSCs成骨分化过程中,circRNA＿1809和Kitlg的表达水平呈明显呈现升高趋势,miR-370-3p则呈降低趋势,基因动态表达量的变化符合ce RNA的调控机制;茜素红染色和Von Kossa染色表明敲低circRNA＿1809的表达可以显著抑制rBMMSCs的成骨分化;q RT-PCR和蛋白质免疫印迹检测证明:敲低circRNA＿1809显著降低碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）和骨形态发生蛋白-2（Bone morphogenetic protein-2,BMP-2）的表达量,敲低miR-370-3p会明显提升rBMMSCs成骨分化的能力,但过表达miR-370-3p会抑制rBMMSCs的成骨分化;双荧光素酶报告证实了miR-370-3p与circRNA＿1809的可结合性,miR-370-3p mimics和miR-370-3p inhibitor分别下调和上调Kitlg在rBMMSCs中的表达量,而si-circRNA＿1809转染rBMMSCs同样会下调Kitlg在rBMMSCs中的表达量,si-circRNA＿1809+miR-370-3p inhibitor共转染会逆转一部分si-circRNA＿1809对Kitlg的下调作用,而si-circRNA＿1809+miR-370-3p mimics则会强化对Kitlg的下调作用。第三部分:手术后第4周和第8周处死SD大鼠并收集其股骨样本,HE染色和Von Kossa染色显示回植si-circRNA＿1809+rBMMSCs的实验组大鼠骨缺损区域内新骨形成量比回植空白rBMMSCs的对照组大鼠少,骨修复速度也比对照组慢;Micro-CT和X-ray影像学显示:敲低circRNA＿1809组的大鼠相比对照组大鼠骨密度低,骨缺损区域的新生骨组织少;免疫组化染色的结果也观察到敲低circRNA＿1809组大鼠的成骨相关指标OSX和OPN均低于对照组。结论:1.通过高通量测序获取了rBMMSCs成骨过程中明显差异表达的29个circRNA和2453个mRNA。运用生物信息学分析方法预测出大量ce RNA调控通路可能与rBMMSCs成骨分化相关,证明circRNA与rBMMSCs的成骨过程有密不可分的联系。2.rBMMSCs成骨分化过程中circRNA＿1809显著高表达,而miR-370-3p呈现低表达。双荧光素酶报告证明两者之间具有ce RNA的竞争关系,circRNA＿1809通过吸附miR-370-3p对rBMMSCs的成骨分化进行调控。3.miR-370-3p可以与下游靶基因Kitlg结合,调控Kitlg基因的表达量,因此circRNA＿1809可通过吸附miR-370-3p促进Kitlg的表达,进而可能通过调控PI3K/Akt信号通路促进rBMMSCs的成骨分化。4.沉默circRNA＿1809修饰rBMMSCs回植SD大鼠股骨缺损区,可以在体内抑制大鼠的骨修复进程。