目的:骨质疏松症是一种常见的代谢性疾病,好发于绝经后的女性。骨质疏松患者表现为骨密度降低,骨微结构破坏和骨骼脆性增加,从而大大增加了骨折的风险,严重影响患者的正常生活。绝经后女性雌激素缺乏导致破骨细胞骨吸收作用超过成骨细胞的骨形成作用,但具体的发病机制尚不明确。目前,骨质疏松的治疗主要以抑制破骨类的药物为主,其疗效在于遏制骨质的进一步流失,治疗效果存在局限。因此,需要明确绝经后骨质疏松的发病机制并开发针对提高成骨能力的药物。研究发现,氧化应激损伤与绝经后骨质疏松的发展密切相关。氧化应激是一种由于体内活性氧过量堆积导致的病理状态。临床研究发现患有骨质疏松的绝经后女性血清氧化相关的生物标志物,包括抗氧化酶和高级氧化产物的含量变化表明这类患者机体处于高度氧化状态。同时,雌激素本身也是一类还原性的激素,雌激素的缺乏也必然导致机体抗氧化能力下降。在细胞层面,线粒体是细胞内消除自由基和避免氧化应激损伤的关键细胞器。其内部的抗氧化酶活性降低导致细胞通过线粒体凋亡途径发生凋亡,这也是骨质疏松患者成骨细胞功能减弱的重要原因。近期,老药新用越来越称为研究者关注的热点。特别是二甲双胍,被证明在许多疾病中有治疗的效果。其中最值得关注的是,二甲双胍可以延缓机体衰老,并且其作用机制是消除机体产生的过量的自由基,这便启示二甲双胍在绝经后骨质疏松中存在潜在的治疗作用。因此,我们旨在探索二甲双胍对成骨细胞氧化应激损伤的保护机制及对绝经后骨质疏松的治疗作用。研究方法:1、应用CCK-8试剂检测二甲双胍和H2O2对成骨细胞活性的影响;2、应用碱性磷酸酶试剂盒检测二甲双胍对成骨细胞分化的影响;3、应用茜素红染色方法检测二甲双胍对成骨细胞矿化的影响;4、应用转录组测序技术检测二甲双胍诱导成骨细胞分化表达的差异基因;5、应用Annexin V-FITC试剂盒检测二甲双胍对成骨细胞氧化损伤凋亡的保护作用。6、应用JC-1试剂盒检测线粒体膜电位的变化;7、应用RT-PCR检测目的基因表达的m RNA水平;8、应用蛋白免疫印迹实验技术（Western blotting）检测目的蛋白的表达;9、应用Si RNA细胞转染技术调控目的基因的蛋白表达;10、应用micro-CT检测小鼠股骨皮质与松质骨的相关参数;11、应用总SOD试剂盒,T-AOC试剂盒检测小鼠血清抗氧化标志物水平;12、统计分析:文章中涉及的结果都进行了3次重复的独立实验,并应用Graph Pad软件进行分析,采用双侧t检验或单因素方差的分析确定统计学意义,p＜0.05具有统计学意义。结果:1、H2O2对成骨细胞活性随浓度增高,抑制效果越明显。分别用0m M;0.1m M;0.2m M;0.3m M的H2O2处理成骨细胞6小时,CCK8检测结果显示随着H2O2浓度的加大,成骨细胞活性越低,且在0.2m M H2O2处理时的细胞状态越接近真实的细胞氧化损伤状态。适宜浓度的二甲双胍促进成骨细胞活性升高。分别用0m M;0.1m M;0.2m M;0.3m M;0.4m M的二甲双胍处理成骨细胞24小时,48小时和72小时。结果显示随时间的推移,成骨细胞活性越高,0.2m M二甲双胍处理时的细胞活性最高,但0.4m M二甲双胍相对于未处理对成骨细胞活性表现出抑制作用。2、二甲双胍可以促进成骨细胞分化和逆转氧化损伤导致的凋亡。分别用0m M;0.1m M;0.2m M;0.3m M二甲双胍与成骨培养基混合处理成骨细胞7天,应用碱性磷酸酶试剂盒检测细胞ALP水平,应用RT-PCR检测成骨细胞Collagen I,OCN,Runx2的m RNA水平,应用Western blotting检测成骨细胞Collagen I,OCN,Runx2的蛋白水平。结果显示0.2m M二甲双胍处理时,成骨细胞各项分化指标最高。此外,分别用0m M;0.1m M;0.2m M;0.3m M二甲双胍与0.2m M H2O2混合处理成骨细胞6h,应用Annexin V-FITC试剂盒检测成骨细胞凋亡率。结果显示二甲双胍处理可以降低H2O2单独处理时成骨细胞的凋亡率,且在0.2m M二甲双胍与0.2m M H2O2混合处理时,凋亡率最低。3、二甲双胍增强成骨细胞的矿化作用,分别用0m M;0.1m M;0.2m M;0.3m M二甲双胍与成骨培养基混合处理成骨细胞28天,应用茜素红染色,观察细胞大致改变并用显微镜观察矿化结节。结果显示,二甲双胍可增强成骨细胞的矿化作用且在0.2m M处理时,效果最显著。4、二甲双胍可以逆转H2O2诱导的成骨细胞线粒体凋亡。将成骨细胞置于空白组,0.2m M二甲双胍组,0.2m M H2O2组和0.2m M二甲双胍与0.2m M H2O2混合组培养。应用Western blotting检测线粒体凋亡指标Bax,Bcl-2,Caspase3,Cleaved-caspase3,Mitochondrial Cytochrome C和Cytosolic Cytochrome C蛋白的表达。结果显示,二甲双胍处理相较于空白组和H2O2组Bax,Cleaved-caspase3,Cytosolic Cytochrome C蛋白表达量下降,Bcl-2,Caspase3,Mitochondrial Cytochrome C蛋白表达量上升。5、转录组测序明确PI3K/AKT通路和氧化还原反应介导二甲双胍促进成骨细胞分化。分别将成骨细胞置于单独成骨培养基和成骨培养基与0.2m M二甲双胍混合培养基中培养3天。处理后的细胞进行转录组测序并分析差异基因。结果显示二甲双胍处理后共有1946个表达上调基因和1544个表达下调基因。对上调基因进行GO基因功能和KEGG通路分析得出,这些上调基因富集在氧化还原反应和PI3K/AKT通路上。6、二甲双胍可以扭转H2O2对成骨细胞分化的抑制作用。将成骨细胞置于分化诱导组,0.2m M H2O2加成骨诱导组和0.2m M二甲双胍与0.2m M H2O2混合加成骨诱导组。应用Western blotting检测成骨细胞Collagen I,OCN,Runx2的蛋白水平。结果显示,二甲双胍处理相较于单纯成骨诱导组和H2O2组,Collagen I,OCN,Runx2的蛋白水平升高。7、PI3K/AKT通路抑制剂降低二甲双胍对成骨细胞分化和矿化的促进作用。在成骨培养基和二甲双胍的混合培养基中加入PI3K/AKT通路抑制剂LY294002。应用Western blotting检测成骨细胞Collagen I,OCN,Runx2的蛋白水平。结果显示,加入LY294002后,Collagen I,OCN,Runx2的蛋白水平均下降。应用茜素红染色技术,发现加入LY294002后,成骨细胞矿化能力减弱,矿化结节数减少。8、二甲双胍可以缓解诱导的H2O2线粒体损伤和抗氧化能力下降。应用JC-I检测试剂盒检测成骨细胞线粒体膜电位变化并应用Western blotting检测成骨细胞SOD 1,CAT的蛋白水平。结果显示,加入H2O2会导致线粒体膜电位下降,抗氧化物酶SOD 1,CAT的蛋白表达水平,而在H2O2的基础上加入二甲双胍后,线粒体膜电位水平及抗氧化物酶SOD 1,CAT的蛋白表达水平均得到改善。9、SIRT3-si RNA使SIRT3基因的表达下降会逆转二甲双胍对H2O2诱导的成骨细胞凋亡的保护作用。应用Annexin V-FITC试剂盒检测成骨细胞凋亡率和Western blotting检测线粒体凋亡指标Bax,Bcl-2,Caspase3,Cleaved-caspase3,Mitochondrial Cytochrome C和Cytosolic Cytochrome C蛋白的表达。结果显示,SIRT3-si RNA转染后,细胞凋亡率升高,Bax,Cleaved-caspase3,Cytosolic Cytochrome C蛋白表达量上升,Bcl-2,Caspase3,Mitochondrial Cytochrome C蛋白表达量下降。10、SIRT3-si RNA使SIRT3基因的表达下降会逆转二甲双胍对H2O2诱导的线粒体损伤的保护作用。应用JC-I检测试剂盒检测成骨细胞线粒体膜电位变化并应用Western blotting检测成骨细胞SOD 1,CAT的蛋白水平。结果显示,SIRT3-si RNA转染后,线粒体膜电位水平及抗氧化物酶SOD 1,CAT的蛋白表达水平均下降。11、二甲双胍通过PI3K/AKT/Nrf2/HO-1通路逆转H2O2诱导的成骨细胞氧化应激损伤。应用Western blotting检测成骨细胞p-PI3K,PI3K,p-AKT,AKT,nuclear Nrf2,HO-1的蛋白表达水平。结果显示相较于H2O2处理,加入二甲双胍后,p-PI3K,p-AKT,nuclear Nrf2,HO-1的蛋白表达水平均上升。在二甲双胍的基础上加入AKT抑制剂MK2206,应用Western blotting检测成骨细胞nuclear Nrf2,HO-1的蛋白表达水平。结果显示,nuclear Nrf2,HO-1的蛋白表达水平均下降。12、二甲双胍可以改善绝经后小鼠骨量和血清抗氧化能力。小鼠双侧卵巢切除模拟绝经模型并肠道灌胃100mg/kg/day二甲双胍8周。应用micro-CT检测小鼠股骨皮质和松质骨参数,应用Western blotting检测小鼠股骨Collagen I,OCN,Runx2,SOD 1,CAT的蛋白水平,并应用Elisa检测小鼠血清SOD和T-AOC水平。结果显示,绝经后小鼠骨质流失,骨量下降,股骨Collagen I,OCN,Runx2,SOD 1,CAT的蛋白水平下降,血清SOD和T-AOC水平下降,而二甲双胍灌胃后,上述指标均得到改善。结论:1、二甲双胍可以促进成骨细胞增殖分化。2、二甲双胍通过PI3K/AKT通路促进成骨细胞分化。3、二甲双胍通过上调SIRT3基因表达维持线粒体功能并通过PI3K/AKT/Nrf2/HO-1通路缓解H2O2诱导的成骨细胞氧化应激损伤。4、二甲双胍可以缓解绝经后小鼠的骨量降低和改善血清抗氧化标志物水平。