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近年来,假体设计的革新和手术技术的改良,使术后效果愈发理想。然而,虽然假体的磨损和假体周围感染的问题已经得到较好的解决,但是假体非机械性、无菌性松动的病因尚未确定。有学者认为关节假体周围成骨和骨溶解不平衡是导致人工关节假体骨溶解的主要原因,但其发病机制尚未完全阐明。近年来,环状RNA（circ RNAs）作为一种新型非编码RNA被广泛报道,并被认为与多种疾病密切相关。越来越多的研究证据表明circ RNAs作为一种竞争性内源RNA（ce RNAs）,可与微小RNA（mi RNAs）结合并调节其下游功能。目前已有研究发现,环状RNA在骨外科某些退行性疾病（如骨关节炎）、代谢性疾病（如骨质疏松症）及骨肿瘤（如骨肉瘤）等疾病的发病机制、诊断依据、靶向治疗等方面均发挥着至关重要的作用。我们团队前期研究表明circ RNA可能与假体骨溶解的某些生物学功能和作用通路相关,并坚信对circ RNA-mi RNA-m RNA信号通路的进一步研究将揭示假体周围骨溶解的新的发病机制和治疗策略。本研究由以下三部分构成:第一部分:研究circ＿0000690在假体周围骨溶解（PPO）微环境成骨细胞内的表达目的:对人工髋关节PPO患者的标本组织进行高通量测序分析;q RT-PCR验证circ＿0000690在人工髋关节PPO患者中和在体外与钛颗粒共同培养的成骨细胞系中的表达情况;通过生物信息学分析来预测circ＿0000690下游的mi RNA和m RNA。研究方法:本研究收集12例全髋关节置换术后PPO患者的假体周围骨组织为实验组,以及12例因股骨颈骨折而行初次人工髋关节置换患者的骨折端骨组织为对照组。对收集的临床标本进行高通量测序分析,筛选出在全髋关节置换术后假体无菌性松动骨溶解组织中表达明显差异的circ RNAs。进一步通过q RT-PCR验证确定本研究的目标circ RNA在人工髋关节PPO患者中和在体外与钛颗粒共同培养的成骨细胞系中的表达情况,同时通过生信分析来预测其下游的mi RNA和m RNA,并绘制ce RNA调控网络图。结果:高通量测序共筛选出257个circ RNAs在全髋关节置换术后PPO患者组织中表达具有明显差异,其中circ＿0000690的表达为显著下调;用Target Scan和Circular RNA Interactome来预测其下游的mi RNA和m RNA,并绘制ce RNA调控网络图;q RT-PCR结果证实circ＿0000690在人工髋关节PPO患者中和在体外与钛颗粒共同培养的成骨细胞系中的表达明显下调。结论:在PPO骨组织成骨细胞内,circ＿0000690的基因表达呈抑制状态。第二部分研究circ＿0000690参与调控成骨细胞细胞凋亡的作用目的:明确circ＿0000690在体外对人成骨细胞系生物行为的影响。研究方法:合成针对circ＿0000690的过表达质粒和si RNA片段转染至人成骨细胞内,验证circ＿0000690在体外对于人成骨细胞系生物行为的影响。结果:与阴性对照组相比,circ＿0000690过表达组人成骨细胞增殖能力显著增强、成骨细胞凋亡比例明显降低、凋亡相关蛋白表达明显下调、抗凋亡蛋白及细胞周期蛋白表达明显上调;circ＿0000690敲减组人成骨细胞增殖能力显著减弱、成骨细胞凋亡比例明显升高、凋亡相关蛋白表达明显上调、抗凋亡蛋白及细胞周期蛋白表达明显下调。结论:Circ＿0000690可参与正向调控成骨细胞的增殖,抑制成骨细胞的凋亡。第三部分研究circ＿0000690/mi R-361-3P/RHBDF2参与调控成骨细胞凋亡的分子机制目的:探索circ0000690影响在体外培养的成骨细胞系生物学功能的分子机制。研究方法:FISH实验验证circ＿0000690的亚细胞定位;应用Circular RNA Interactome、Target Scan等生物信息学数据库预测circ＿0000690和mi R-361-3P与靶基因RHBDF2的相互作用关系,双荧光素酶报告基因实验验证其靶向结合;应用免疫组化方法证实RHBDF2在THA术后PPO骨溶解患者中的表达情况;通过Realtime-PCR检测PPO患者中mi R-361-3P和RHBDF2的表达情况并分析与circ＿0000690的相关性;应用Realtime-PCR及Western Blot检测circ＿0000690表达变化对mi R-361-3P和RHBDF2表达的影响;检测mi R-361-3P表达变化对RHBDF2表达的影响;细胞Rescue实验验证circ＿0000690发挥分子海绵作用,吸附mi R-361-3P,通过circ＿0000690/mi R-361-3P/RHBDF2轴参与调节成骨细胞凋亡的生物学行为。结果:FISH试验结果提示circ＿0000690主要定位于细胞浆中。RNase R实验证实circ＿0000690的环状结构存在。Mi R-361-3P是circ＿0000690的下游靶基因:生物信息学预测circ＿0000690可靶向结合mi R-361-3P,mi R-361-3P在THA术后PPO患者中高表达,与circ＿0000690呈负相关,双荧光素酶报告基因检测进一步确定两者靶向结合,过表达circ＿0000690可以下调mi R-361-3P的表达。RHBDF2是mi R-361-3P调控的下游靶基因:免疫组化结果证实RHBDF2在THA术后PPO患者中明显低表达;生物信息学预测mi R-361-3P和RHBDF2靶向结合,并与circ＿0000690存在共同结合位点,circ＿0000690和RHBDF2可竞争结合mi R-361-3P;RHBDF2基因在THA术后PPO患者中明显低表达,和mi R-361-3P的表达呈明显负相关,双荧光素酶报告基因进一步确定两者靶向关系,过表达mi R-361-3P可以抑制RHBDF2表达。Circ＿0000690通过吸附mi R-361-3P影响RHBDF2表达从而调控THA术后PPO的生物学行为:在THA术后PPO患者中circ＿0000690表达水平和RHBDF2明显正相关,过表达circ＿0000690后可促进RHBDF2的表达;共转染mi R-361-3P mimics可以抑制circ＿0000690过表达对RHBDF2表达上调的影响;共转染mi R-361-3P mimics可以抑制circ＿0000690过表达对人成骨细胞的增殖、凋亡和周期的影响;共转染mi R-361-3P mimics可以抑制circ＿0000690过表达对凋亡和周期相关蛋白cleaved Caspase-3、Bcl-2和cyclin D1表达水平的影响。结论:在成骨细胞中,circ＿0000690发挥分子海绵作用,竞争性抑制mi R-361-3P,进而正向调控靶基因RHBDF2,通过circ＿0000690/mi R-361-3P/RHBDF2通路参与抑制成骨细胞凋亡。总结论:环状RNA circ＿0000690通过circ＿0000690/mi R-361-3P/RHBDF2通路负向调控成骨细胞凋亡、参与PPO生物学效应。