[研究背景]慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia, CML)是一种发生于造血干细胞水平的血液系统恶性克隆增生性疾病,在我国CML占总白血病发病率的20%左右。特征性Ph染色体是CML的标记性改变,它是由于t(9;22)(q34;q11)染色体易位形成的,从而导致BCR-ABL基因融合并表达210KD的BCR-ABL融合蛋白。第一代以BCR-ABL蛋白为靶标的分子靶向药物--伊马替尼(Imatinib, IM)已成为治疗CML的一线药物,但其仍存在耐药、停药后易复发以及对CML急变疗效差等诸多问题。并且,越来越多的临床和实验研究资料显示,单用分子靶向药物只能控制慢性期CML,而对加速期和急变期CML基本无效,更不能治愈CML。随着近年来不断深入的研究,揭示白血病干细胞(leukemia stem cell, LSC)是白血病复发和耐药的主要根源,CML患者要获得长期缓解和治愈,不仅需要杀死快速增殖的白血病细胞,而且还要清除处在休眠期的白血病干细胞。令人遗憾的是,伊马替尼类分子靶向药物对白血病干细胞无效。现代肿瘤的治疗已从最初的单一用药向联合用药方向转变,从机制的互补、作用的协同、不良反应的减轻等方面发挥作用,其中关键之一是联合化疗药物的选择。越来越多的研究证据表明传统中药(traditional Chinese medicine, TCM)是白血病治疗突破新的希望之一。小檗胺(Berbamine, BBM)是从我国中草药小檗属植物中提取的一种双苄基异喹啉类生物碱药物。我们前期研究结果显示,在体外小檗胺可以有效抑制对伊马替尼耐药的CML细胞的增殖,并且对正常造血细胞增殖没有明显抑制作用。CaMKIIy激酶是小檗胺抗慢性粒细胞白血病作用的关键靶分子,是白血病干细胞治疗性药物靶标。这些证据提示着我们可以将小檗胺和伊马替尼联合起来,从而达到对白血病更好的治疗效果。因此本研究将对进该联合用药的可行性及优势进行分析,并对机制进行初步探讨。[研究目的]1比较天然小分子化合物小檗胺、伊马替尼和小檗胺联合伊马替尼对CML细胞的清除作用；2应用小鼠模型比较小檗胺、伊马替尼和小檗胺联合伊马替尼对体内CML药效；3初步探讨小檗胺、伊马替尼和小檗胺联合伊马替尼抗白血病作用机制。[研究方法]1MTT法检测不同浓度单药小檗胺、单药伊马替尼及小檗胺和伊马替尼联合给药方案对伊马替尼耐药的K562细胞或BCR-ABLT315I耐药突变的KCL-22M的清除作用,计算联合指数(combination index,CI);2软琼脂克隆形成实验检测不同浓度单药小檗胺、单药伊马替尼及小檗胺和伊马替尼联合给药方案对白血病细胞系的克隆形成能力的影响；3应用流式细胞术Annexin-V/PI双标法观察不同浓度单药小檗胺、单药伊马替尼及小檗胺和伊马替尼联合给药方案对白血病细胞的凋亡影响；4应用Western blotting检测相关信号分子,研究小檗胺联合伊马替尼诱导CML细胞死亡的机制；5应用裸鼠体内人异种移植瘤模型评价单药小檗胺、单药伊马替尼及小檗胺和伊马替尼联合给药方案对伊马替尼耐药的K562/ADR细胞生长影响。[研究结果]1.体外MTT证实小檗胺和伊马替尼对K562.K562/ADR.KCL-22M.CML-BC四种细胞均有杀伤作用。72h IC50分别为：10.02±0.064μM.12.538±0.073μM.14.759±0.08μM.14.194±0.032μM和0.065±0.011μM.2.665±0.031μM.14.678±0.077¨M.0.065±0.012μM；2.小檗胺和伊马替尼在CML细胞系中联合使用CI<1,具有协同作用,不仅可减少伊马替尼剂量使用,并且可清除对伊马替尼耐药的K562细胞和BCR-BLT315I耐药突变的CML细胞；3.软琼脂克隆形成实验证实小檗胺和伊马替尼联合使用可以协同抑制CML细胞克隆形成,72h MTT IC50药物剂量联合使用后基本无克隆生长；4.流式细胞术检测发现小檗胺和伊马替尼联合使用可协同促进白血病细胞凋亡和坏死,72h MTTIC50药物剂量联合使用后,对K562和K562/ADR凋亡和坏死率分别达到69.1%和97.1%；5.小檗胺下调伊马替尼耐药的K562细胞和BCR-ALBL T315I耐药突变的CML细胞融合蛋白p210BCR-ABL水平,同时抑制CML干细胞存活必需的CaMKIIγ,激酶活性。小檗胺和伊马替尼联合后能使p210BCR-ABL蛋白水平下降更明显；6.体内异种移植瘤证实小檗胺和伊马替尼联合可明显协同抑制K562/ADR细胞在裸鼠体内的生长；裸鼠移植瘤实验35天结束后发现在裸鼠移植瘤瘤重,瘤消退率等指标上联合用药均优于单药,数据均有统计学意义(p<0.05),且裸鼠肝、肾等重要脏器未见肉眼损害。[研究结论]1小檗胺可有效清除LSCs和BCR.ABL的T315I突变细胞,小檗胺能抑制CML细胞中CaMKII γ激酶活性,杀伤CML细胞。2小檗胺和伊马替尼联合用药具有协同效应。小檗胺能显著协同伊马替尼杀伤CML细胞,使细胞凋亡增加；联合用药能协同抑制BCR-ABL及其磷酸化蛋白的表达,提示小檗胺联合伊马替尼可能是逆转耐药。3治疗剂量下小檗胺对裸鼠没有明显的毒副作用,小檗胺联合伊马替尼后能有效杀灭裸鼠体内增殖活跃的人慢性粒细胞白血病细胞4小檗胺能加强伊马替尼的抗肿瘤疗效,由于小檗胺的价格低廉,毒副作用较小,因此,小檗胺联合伊马替尼有望通过协同作用减少伊马替尼的用量,在加强抗白血病作用的同时减轻伊马替尼的副作用,对伊马替尼耐药或者复发的患者具有潜在的临床应用价值。