研究背景HLA-G是主要组织相容复合物　(MHC) Ib分子,选择性表达于母胎界面。研究发现HLA-G在人类生殖有多方面的功能。小鼠植入前胚胎发育基因　(Ped)　产物Qa-2蛋白是小鼠的MHC Ib分子,研究发现表达Qa-2蛋白的小鼠胚胎卵裂速度明显加快,并且更容易存活。许多IVF中心的数据表明在人类胚胎也存在小鼠的Ped现象因为受精时间相同的胚胎会有不同的卵裂速度和IVF结局。HLA-G被证明在人类早期胚胎有表达,并且研究发现人类的HLA-G可能是小鼠Qa-2蛋白的功能类似物。最近大量的研究发现在IVF周期中分泌的可溶型HLA-G的胚胎可能会有更高的种植率、妊娠率和活产率。成功的妊娠只有在发育良好的早期胚胎植入子宫蜕膜并且不被母体免疫系统所排斥才能实现。种植过程的开始是由囊胚的滋养细胞与蜕膜表面的上皮细胞接触并建立联系,然后是两者之间紧密的粘附和浸润子宫蜕膜。有粘附能力的滋养细胞和接受状态的子宫内膜都是必需的。这一过程部分是由滋养细胞和母体子宫微环境控制的。dNK细胞是主要的母体蜕膜免疫细胞,可用直接裂解滋养细胞。HLA-G被认为可以保护靶细胞(滋养细胞和某些肿瘤细胞)不被NK细胞裂解。许多研究表明某些由于滋养细胞增殖和浸润异常有关的妊娠相关疾病与HLA-G的异常表达有关。因此,HLA-G可能具有调节滋养细胞增殖、分化的功能,同时保护这些细胞免受母体免疫细胞的攻击。HLA-G的研究是一个相对较新的领域,目前HLA-G的确切功能仍然不明确。需要大量的研究工作对其进行深入研究。阐明HLA-G的功能和作用机制对我们深入了解妊娠的免疫调节状态和妊娠相关疾病的发病机制有重要意义。同样有助于了解移植物的免疫排斥反应和肿瘤的浸润机制。我们的研究对辅助助孕技术有潜在的临床应用价值。研究目的基于大量的研究认为HLA-G是对人类生殖过程极其重要的分子,我们假设缺乏HLA-G的滋养细胞更易于被母体免疫细胞攻击,粘附和浸润子宫蜕膜不良。这种缺陷的滋养细胞会导致胚胎植入失败和与蜕膜浸润不良胎盘浅着床有关的疾病。低表达HLA-G的滋养细胞和人类早期胚胎可能会有增殖和卵裂障碍,导致胎盘和胚胎发育不良。本研究的目标是阐明下述几个问题:(1)在滋养细胞来源的细胞系中,HLA-G表达水平的改变是否会引起NK对其细胞毒作用的变化;(2) HLA-G是否有促进人类早期胚胎和滋养细胞来源细胞分裂和增殖的功能;(3) HLA-G是否能调控滋养细胞来源细胞的粘附和浸润过程。　研究方法应用RNAi技术,我们创新构建了可以转录出特异干涉HLA-G mRNA的siRNA的重组腺病毒载体来下调HLA-G表达水平。使用高表达HLA-G的JEG-3细胞系(来源于人绒毛膜癌细胞)进行滋养细胞功能研究。通过RT-PCR和Western blot检测重组腺病毒载体转染后JEG-3中HLA-G表达水平,建立HLA-G低表达的滋养细胞模型。用这种细胞模型进行非放射法NK细胞毒实验。用重组腺病毒载体转染或抗HLA-G单克隆抗体封闭后的JEG-3细胞进行增殖和浸润实验。增殖实验采用XTT法。浸润实验使用购买的invasion试剂盒。通过X-Gal染色法检测重组腺病毒载体感染小鼠胚胎的效率并确定最佳MOI值。使用腺病毒载体转染3 PN的第3天人类胚胎,观察卵裂速度的变化。结果(1)我们构建的重组腺病毒载体可以高效转染JEG-3细胞,在MOI 100时感染效率可达到100%,并且产生明显HLA-G RNAi效果,可以降低JEG-3细胞中23.73% HLA-G mRNA和48.36% HLA-G蛋白表达水平;(2) JEG-3细胞中HLA-G表达水平的降低可以明显增加NK 92细胞对其的杀伤作用;在E:T比例为10:1, 5:1和2.5:1时,HLA-G siRNA组和错配对照组的%细胞毒分别是: 58.82%比67.65%, 51.47%比60.29%和39.71%比48.53%,差异有显著性;(3) Ad可以有效转染小鼠和人类早期胚胎;使用106 pfu/ml诱导HLA-G RNAi的腺病毒载体感染的3PN第3天人类胚胎,感染后的胚胎卵裂速度明显减慢,92.31% (12 of 13)感染后胚胎在继续培育的2天里停止分裂,培养至第5天的胚胎平均卵裂球数只有17.71±6.57个。(4)用重组腺病毒载体转染或抗HLA-G单克隆抗体封闭后的JEG-3细胞增殖速度减慢,但结果没有统计学意义。下调JEG-3细胞HLA-G表达后细胞浸润能力显著下降:转染错配对照Ad组和转染AdsiRNA组的OD592值分别为0.790±0.048和0.605±0.133,有统计学差别;加入Anti HLA-G MAb 4H84 1ug/ml组与0ug/ml组OD592值分别为0.626±0.106和0.923±0.025,有统计学差别。结论这些结果表明我们构建的重组腺病毒载体是建立低表达HLA-G的滋养细胞和胚胎模型进行HLA-G功能研究的有效工具。据我们所知这是首次使用转录siRNA的腺病毒载体进行HLA-G在人类早期胚胎功能的研究。我们的结果直接显示了HLA-G对JEG-3细胞具有保护其免受NK杀伤的功能。此外,HLA-G在人类生殖过程中具有非免疫学功能。我们发现HLA-G低表达胚胎卵裂速度显著减慢。HLA-G表达和卵裂速度的这种相关性表明HLA-G在人类早期胚胎发育过程中可能起到重要作用。通过低表达HLA-G的JEG-3增殖和浸润功能实验,我们发现在胚胎植入和胎盘形成过程中HLA-G可能具有调节滋养细胞分裂和浸润等行为的功能。