研究背景:乳腺癌已超过肺癌成为全球发病率最高的恶性肿瘤,居女性恶性肿瘤死亡首位。三阴性乳腺癌（Triple negative breast cancer,TNBC）是雌激素受体、孕激素受体以及人表皮生长因子2受体表达阴性的一种乳腺癌亚型,因其缺乏标准治疗靶点、具有高侵袭和转移特性,且在术后早期极易复发,给临床治疗带来极大困难。化疗仍然是目前治疗TNBC有效且最主要的治疗手段,但化疗在使用过程中产生的不良反应,大大降低了患者的生活质量,更有部分患者难以耐受致使化疗中断,肿瘤进展。因此,寻找有效且低毒的治疗TNBC的药物,对于TNBC患者具有重要意义。目前已有许多研究证实中医中药在治疗恶性肿瘤方面有潜在优势,特别是其抗癌低毒或者减毒的优势,被诸多临床医生认可,并将其应用于肿瘤患者的辅助治疗中。西黄解毒胶囊作为中国中医科学院广安门医院院内制剂,自二十世纪六十年代被研发出来被用于乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌等恶性肿瘤的治疗,其在患者群体中良好的疗效,使其至今仍在肿瘤患者中广泛使用。因此,我们推测西黄解毒胶囊可能对三阴性乳腺癌有治疗作用。本研究在开始前以“西黄解毒胶囊”为主题词检索了三大中文数据库,以“Xihuang Jiedu Capsules”为自由词,检索了三大英文数据库,获得与乳腺癌相关文献1篇,该文献探讨的是乳腺癌创伤后应激障碍,而关于西黄解毒治疗TNBC相关文献未检索到。因此本研究将以TNBC为研究对象,西黄解毒胶囊为干预药物,探索西黄解毒胶囊治疗TNBC的疗效及可能机制。研究目的:1.通过体内实验和体外实验研究西黄解毒胶囊对TNBC生长、增殖、凋亡、侵袭、转移能力和炎症因子表达的影响。2.基于网络药理学探索西黄解毒胶囊治疗TNBC的可能机制。3.体内和体外实验对西黄解毒胶囊治疗TNBC的机制进行初步验证。研究方法:1.药效学研究将西黄解毒胶囊用DMSO溶解,超声助溶后,离心,取含药上清,用于干预4T1细胞,24h后CCK8检测细胞活力、平板克隆形成实验观察细胞增殖情况、流式细胞数检测细胞凋亡情况,Transwell实验、划痕实验以及免疫荧光检测细胞中E-Cadherin和N-Cadherin的表达,来检测各组细胞的侵袭和迁移情况。6周龄,体重17-19g雌性Balb/c小鼠,给予第二乳垫下接种4T1细胞,建立TNBC荷瘤小鼠模型,接种第二天开始给药干预,分为模型组、化疗组、西黄解毒高、中、低剂量组及联合组,连续给药21天,取材。观察各组小鼠毛发光泽度、精神状态、活动量等一般状态;观察各组小鼠体重变化;观察各组小鼠移植瘤生长情况;观察各组小鼠移植瘤的大小,称瘤重,计算抑瘤率;取小鼠肺组织,称肺重,比较各组小鼠肺重的差异。将瘤组织置于福尔马林中固定,石蜡包埋,tunel染色检测各组移植瘤细胞凋亡情况,免疫组化染色检测各组移植瘤中E-Cadherin和N-Cadherin的表达;HE染色检测肺转移情况;Elisa检测小鼠血清中IL-6、IL-22、IL-17的表达情况。2.机制探索采用网络药理学的方法,分别在TCMSP数据库和查阅相关文献,检索西黄解毒胶囊中所含药物的有效活性成分,在TCMSP数据库靶点筛选栏和SwissTargetPrediction数据库筛选活性化合物对应的人类基因靶点。在GEO数据库中检索获得TNBC的原始基因表达谱数据（GSE38959）,进行GEO2R分析,以获得TNBC相关差异表达基因。将药物靶点与疾病靶点相映射取交集,获得西黄解毒胶囊治疗TNBC的靶点,将交集靶点导入String在线数据库构建PPI网络,根据度值筛选西黄解毒胶囊治疗TNBC的核心靶点,在DAVID数据库对西黄解毒胶囊治疗TNBC的关键靶点进行GO和KEGG富集分析,以探索西黄解毒胶囊治疗TNBC的可能机制。3.机制研究经上述网络药理学方法预测西黄解毒胶囊治疗TNBC可能参与的信号通路。分别采用Western Blot和荧光定量PCR检测信号通路上关键信号分子的表达情况。研究结果:1.药效学研究体外研究:（1）CCK8结果显示,随着西黄解毒给药浓度的升高,细胞活力呈下降趋势,西黄解毒高剂量组与培养基组相比差异具有统计学意义（P＜0.05）;（2）平板克隆形成实验结果显示,培养基组和DMSO组细胞克隆灶个数没有显著差异（P＞0.05）。与培养基组和DMSO组相比,西黄解毒高、中、低剂量组能显著减少4T1细胞克隆灶个数（P＜0.01）。（3）流式细胞术检测细胞凋亡结果显示,培养基组和DMSO组细胞凋亡率没有明显差异（P＞0.05）,与培养基组相比,西黄解毒高剂量组显著增加了凋亡细胞比例,差异具有统计学意义（P＜0.01）。（4）Transwell侵袭实验结果显示,培养基组与DMSO组在侵袭细胞数量上无统计学差异（P＞0.05）;与培养基组相比,西黄解毒高、中、低剂量组显著降低了侵袭细胞个数,差异具有统计学意义（P＜0.05）。（5）划痕愈合实验结果显示,培养基组和DMSO组在划痕愈合率方面无显著差异（P＞0.05）,西黄解毒高、中、低剂量组,较前两组均呈现出下降的趋势,且高剂量组与培养基组相比差异具有统计学意义（P＜0.05）。（6）免疫荧光检测结果显示:培养基组和DMSO组在E-cadherin和N-cadherin的平均光密度上没有差异（P＞0.05）;与培养基组相比,西黄解毒高、中、低剂量组能显著上调E-cadherin、下调N-cadherin蛋白的表达,差异具有统计学意义（P＜0.01）。（7）Elisa检测结果显示,培养基组和DMSO组在IL-6、IL-22、IL-17的表达方面没有显著差异（P＞0.05）;与培养基组和DMSO组相比,西黄解毒高、中、低剂量组能显著降低IL-6、IL-17的表达,差异具有统计学意义（P＜0.05）;有降低IL-22的趋势。体内研究:（1）通过对小鼠一般状态进行观察,发现化疗组小鼠在化疗后,小鼠的精神状态逐渐变差,毛发欠光泽,活动减少,联合组则表现出轻微的活动减少,其他各组小鼠一般状况均在正常范围内。给药期间观察各组小鼠体重的变化,发现在给药前各组小鼠体重无明显差异,在给药第12天,化疗组小鼠体重明显下降,与模型组、西黄解毒高、中、低剂量给药组相比差异均具有统计学意义（P＜0.01）;联合组小鼠体重尽管也呈现下降趋势,但显著高于化疗组,差异具有统计学意义（P＜0.01）。（2）随着时间的增加,所有组小鼠的肿瘤体积均呈现增长趋势,模型组增长最快,化疗组、联合组肿瘤生长最慢,其次为西黄解毒高剂量组。对第21天肿瘤体积进行统计学分析结果显示,与模型组相比,西黄解毒高、低剂量组、化疗组和联合组能显著抑制肿瘤的生长,差异具有统计学意义（P＜0.05）。（3）与模型组相比,化疗组与联合组能明显降低荷瘤小鼠实体瘤重量,差异具有统计学意义（P＜0.01）。西黄解毒高、中、低剂量组尽管未在降低瘤重方面显示出统计学差异,但都显出降低瘤重的趋势,其中高剂量组抑瘤率最高（24.44%）。化疗组与联合组在降低瘤重方面无统计学差异,但联合组显示出更好的抑瘤趋势（68.57%vs63.81%）。（4）荷瘤小鼠肺重与瘤重整体呈现出较为一致的趋势,即瘤重越大肺重越大。尽管组间比较均未显示出统计学差异,但与模型组相比,其他各组均显示出降低肺重的趋势,特别是联合组、化疗组和西黄解毒高剂量组降低最为明显。（5）Tunel染色检测移植瘤凋亡情况结果显示,与模型组相比,西黄解毒高、中、低剂量组、化疗组和联合组均能显著增加凋亡细胞百分比,差异具有统计学意义（P＜0.01）;与化疗组相比,联合组增加更为明显,差异具有统计学意义（P＜0.01）。（6）HE染色结果显示,与模型组相比,西黄解毒高、中、低剂量组显示出一定降低肺转移的趋势;与化疗组相比,联合组有更好的减少肺转移趋势。（7）免疫组化结果显示,与模型组相比,西黄解毒高、中、低剂量组显著增加了 E-caherin的表达,降低了 N-cadherin的表达,差异具有统计学意义（P＜0.01）;与化疗组相比,联合组在调节以上两个蛋白表达方面有更好的趋势,差异具有统计学意义（P＜0.01）。（8）Elisa检测结果显示,与模型组相比,西黄解毒高、中、低剂量组、化疗组、联合组显著降低了 IL-17、IL-22的表达,差异具有统计学意义（P＜0.01）;西黄解毒高、中剂量组、化疗组、联合组显著降低了 IL-6的表达,差异具有统计学意义（P＜0.05）。与化疗组相比,联合组能显著降低IL-6、IL-17的表达,差异具有统计学意义（P＜0.01）;有降低IL-22的趋势。2.机制探索通过TCMSP共获得西黄解毒胶囊750个化学成分,在TCMSP数据库中匹配到共902个人类靶点;经查阅文献获得麝香14个化学成分,在SwissTargetPredication数据库,共匹配获得599个人类靶基因,去重后分别获得71个活性成分和374个药物靶点。通过在GEO数据库中对TNBC组织和正常乳腺导管细胞的基因表达谱进行分析,共获得5223个差异表达基因,去重后获得3595个。将药物靶点和疾病靶点相互映射取交集共得到96个共同作用靶点。将交集靶点导入STRING平台构建PPI网络,根据度值筛选出西黄解毒胶囊治疗TNBC的核心靶点为HIF1A、VEGFA、ESR1、PTEN、BCL2L1等;将西黄解毒胶囊治疗TNBC的关键靶点导入DAVID生物资源平台,进行GO和KEGG富集分析。GO生物过程主要富集到信号转导、细胞因子介导的信号通路、细胞增殖的正向调节等。KEGG富集到西黄解毒胶囊治疗TNBC的信号通路主要包括癌症信号通路、PI3K-Akt信号通路、凋亡信号通路、P53信号通路、IL-17信号通路和NF-κB信号通路等。基于上述GO和KEGG富集结果,结合既往文献研究,本研究预测西黄解毒胶囊可能通过PI3K/AKT/NF-κB通路发挥抗TNBC的作用。3.机制研究采用Western Blot和荧光定量PCR检测PI3K/AKT/NF-κB信号通路上PI3Kp85、NF-κBp65、AKT、EGFR、p-AKT、p-NF-κBp65、PI3Kp110α 蛋白和对应基因mRNA的表达。体外研究:Western Blot结果显示,与培养基组相比,西黄解毒高剂量组能显著降低 PI3Kp85、NF-κBp65、AKT、EGFR、p-AKT、p-NF-κBp65、PI3Kp110α的表达,差异具有统计学意义（P＜0.05）,西黄解毒中剂量组能显著降低AKT、EGFR、p-AKT、p-NF-κBp65、PI3Kp110α 的表达,差异有统计学意义（P＜0.05）,西黄解毒低剂量组能显著降低PI3Kp85、EGFR、p-AKT、PI3Kp110α的表达,与差异具有统计学意义（P＜0.05）。荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,西黄解毒组均能降低EGFR、PI3K、PI3KCA、NF-κBp65、AKT的表达,其中在降低EGFR、PI3KCA、NF-κBp65方面存在统计学差异（P＜0.05）。体内研究:Western Blot结果显示,与模型组相比,西黄解毒高、低剂量组均能降低 PI3Kp85、NF-κBp65、AKT、EGFR、p-AKT、p-NF-κBp65、PI3Kp110α蛋白的表达,差异具有统计学意义（P＜0.01）;另外,西黄解毒中剂量组能显著降低 PI3Kp85、AKT、EGFR、p-AKT、p-NF-κBp65、PI3Kp110α 的表达,与模型组相比,差异具有统计学意义（P＜0.01）。荧光定量PCR结果显示,西黄解毒组均能降低EGFR、PI3K、PI3KCA、NF-κBp65、AKT的表达,与模型相比差异具有统计学意义（P＜0.01）。研究结论:1.西黄解毒胶囊在体外能显著抑制4T1细胞的生长、增殖,促进其凋亡,并且能抑制其侵袭、迁移能力,降低炎性因子的表达。2.西黄解毒胶囊在体内能显著抑制4T1荷瘤小鼠移植瘤的生长、缩小实体瘤体积、减轻肺转移,而不影响其体重;西黄解毒胶囊能显著增加移植瘤中凋亡细胞数,能通过抑制上皮间质转化,抑制移植瘤侵袭、转移能力,降低血清中炎性因子的表达。3.西黄解毒胶囊在体内、体外抑制了 EGFR、AKT（pan）、p-AKT（Ser473）、NF-κBp65、p-NF-κBp65、PI3Kp85、PI3Kp110α 的表达,提示西黄解毒抗 TNBC可能与抑制了 PI3K/AKT/NF-κB信号通路有关。