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随着越来越多生物基因组测序工作的完成,科学界对转座子在生命科学的重要性的理解和认识也逐渐加深。已有研究表明转座子在生物界分布广泛,对基因和基因组进化发挥重要作用,并可能影响物种分化和品种(品系)形成。另外由于转座特性,一些DNA转座子被成功开发成遗传操作工具,如SB,PB和Tol2等,在转基因、基因治疗和功能基因组学研究领域中得到广泛应用,并取得重要进展。其中,Tc1/mariner超家族是一类广泛分布的DNA转座子。到目前为止,已经鉴定到了 10多个具有天然活性的Tc1/mariner转座子,但只有人工分子重构的SB转座子得到广泛应用。本研究对斑马鱼基因组的Tc1/mariner超家族进行了系统挖掘和高活性成员应用评估,并对Tc1/mariner超家族中的DD41D/VS家族的分布和传播等进化特性进行了系统研究,主要包括以下研究内容:1.重头挖掘了斑马鱼基因组中的Tc1/mariner转座子,并进行了系统分类、插入年龄分析、转座酶结构域预测等研究;2.DD41D/VS转座子家族的分布、插入年龄分析、横向传播规律等研究;3.ZB转座子在哺乳动物中的转座活性和特性分析;4.ZB转座子在斑马鱼增强子捕获中的应用研究,捕获增强子鉴定验证;5.ZB转座子介导鼠精子突变体库构建及增强子捕获研究。主要结果如下:1、对Tc1/mariner超家族中另一个家族DD41D(Visitor,VS)进化分析表明:VS转座子在动物中分布广泛,在140个非脊椎动物和30个脊椎动物(其中12个为哺乳动物,包括1个灵长类)和1个植物检测到VS分布。VS在脊椎动物和非脊椎动物中发生了多次横向传播。进化关系和序列相似性矩阵分析显示DD41D/VS与DD37D/maT和DD34D/mariner关系更近,而DD40D是源自DD41D家族,而非一个独立的进化分支。插入年龄分析表明脊椎动物中VS的插入年龄差异明显,鳍鱼类和蟾蜍为年轻插入,其次是蝙蝠和有袋动物,而无颚鱼类和蜥蜴中主要是古老的VS转座插入。细胞试验表明源自蝙蝠基因组中结构完整的VS转座子已经失去转座活性。2、通过斑马鱼基因组的Tc1/mariner超家族的系统挖掘,共鉴定到10个自主和77个非自主Tc1/mariner转座子,占5.41%(90.69 Mb)。进化关系分析显示:Tc1-1_DR,Tc1-4_DR,Tc1-8B_DR,Mariner-6_DR,Mariner-7_DR,Mariner-13_DR,Mariner-15_DR和Tc1-21_DR这八个转座子属于DD34E/Tc1家族,而Mariner-14_DR属于DD37E/TRT家族,Mariner-18_DR属于DD×D/pogo家族。这些转座酶都具有保守的DNA结合结构域(DBD)和催化结构域(DDE/D)。其中Tc1-8B_DR(命名为ZB转座子)全长1597 bp,中间为1个可编码341 aa的转座酶基因,两侧是201 bp的TIRs,且目标位点重复序列(TSD)为“TA”。ZB转座子在斑马鱼基因组中有25个拷贝,其中能编码完整转座酶的拷贝有20个,同源性大于99%。插入年龄分析显示,ZB转座子最年轻,可能具有较高的活性。3、细胞实验表明高剂量时ZB活性显著高于其他三个常用转座子(SB、PB和Tol2)(p<0.05),且ZB和SB、PB和Tol2一样也存在转座酶过量抑制现象,但存在细胞和剂量差别,在低剂量(10 ng)转座子转染HepG2细胞和高剂量(500 ng)转染Hela细胞时,四个转座子均出现了过量抑制,但是在高剂量(500ng)转染HepG2细胞时,ZB和Tol2没有出现抑制现象。ZB转座后留下“CA/TG”三碱基“足迹”,与SB和Frog Prince转座子相同。ZB插入偏好性分析表明,ZB转座子是非随机插入到基因组中,对基因调控序列有一定的偏好性,且偏好插入6个TA碱基短回文序列(ATATATAT)。4、设计构建了 ZB和Tol2转座子介导的斑马鱼增强子捕获载体,并通过显微注射,分别获得60和87个ZB和Tol2转座子介导的斑马鱼增强子捕获品系。经荧光显微镜检测,ZB介导的增强子捕获效率与Tol2相近,生殖系传递效率分别为55.56%(n=108)和55.77%(n=156)。且ZB比Tol2更倾向于产生单一GFP表达模式后代(p<0.05),Tol2更倾向于产生多GFP表达模式的后代(表型数≥2)。通过Sp-PCR成功注解了 4个ZB(ZK32,ZK36,ZK47和ZK68)和2个Tol2(TK1和TK4)介导的增强子捕获品系。VISTA注解共获得13个潜在的增强子,并对其中的8个进行了增强子鉴定和活性验证。5、设计构建了鼠增强子捕获载体及ZB转座子介导鼠精子突变体库。通过显微注射,分别制备了 ZB转座子和转座酶的转基因鼠,并成功构建含转座子和转座酶的双转基因公鼠4只(精子突变体库),与野生的母鼠杂交制备突变体。通过常规PCR和Linker-PCR对12窝,共135个后代小鼠检测,获得72只ZB转座子转基因阳性鼠,61个后代的插入位点与父本的转座子原插入位点一致,11个后代插入到了新位点,ZB转座子重新转座的效率为15.3%(11/72),高于SB和PB(约10%)。并获得GFP阳性鼠3只(n15、n19和n111),VISTA注解获得11个潜在的增强子。总体而言,本文系统揭示了Tc1/mariner转座子超家族中DD41D/VS家族在生物界的进化规律,及Tc1/mariner转座子在斑马鱼基因组上构成、种类、进化动力学等特性,成功挖掘了高活性ZB转座子,并系统评估了其转座活性和特性,构建了 ZB介导的鼠精子突变体库,在模式动物斑马鱼和鼠上进行增强子捕获应用研究。证实ZB能够高效介导基因转移,在转基因、基因治疗、功能基因组学等研究中具有很大应用潜力。