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研究目的:探讨体外解毒化瘀方联合抗生素对表皮葡萄球菌(Staphylococus epidermidis,SE)生物膜形成及成熟生物膜的影响,明确解毒化瘀方联合抗生素的抗生物膜作用特点,为临床预防和治疗SE生物膜相关的感染提供新思路。研究方法:1、实验用ATCC35984(SE生物膜形成阳性菌株)及ATCC12228(SE生物膜形成阴性菌株)购自美国标准菌库(American type culture collection,ATCC)。采用钛板作为载体,胰酪大豆胨液体培养基(trypticsoy broth,TSB)为培养基,通过扫描电镜(Scanning electron microscope,SEM)观察ATCC35984能否形成生物膜。采用微量稀释法分别测定解毒化瘀方以及临床常用抗生素头孢替安、头孢唑琳钠、克林霉素、庆大霉素、左氧氟沙星及万古霉素等对SE的最小抑菌浓度(Minimum inhibitiory concentration,MIC)以及联合用药的部分抑菌浓度指数(Fractional inhibitiory concentration index,FICI),筛选出对 SE生物膜具有较强抑制作用的药物组合。2、对生物膜形成的影响:根据前期研究选择SE生物膜形成过程中的主要2个培养时间点(即6h细菌黏附阶段和24h细菌聚集阶段)作为观察点。利用药物组合中抑制生物膜最小的FICI组合及各单药组干预不同阶段的SE生物膜形成。然后规定时间点分别采用结晶紫半定量、倍比稀释活菌涂板计数、激光扫描共聚焦显微镜(Confocal laser scanning microscope,CLSM)及SEM等观察对生物膜形成的影响。3、对成熟生物膜的影响:体外建立ATCC35984及ATCC12228生物膜模型。成熟生物膜形成后,利用药物组合中抑制生物膜的最小FICI组合及各单药对成熟生物膜进行干预,规定时间点分别采用结晶紫半定量、倍比稀释活菌涂板计数、CLSM及SEM等观察对成熟生物膜的影响。结果:1、ATCC35984在内含钛片的96孔板内连续培养48h后,SEM观察到ATCC35984在钛片表面形成成熟生物膜,可见表面粘稠致密的胞外基质以及周围较多的SE。对生物膜阳性菌ATCC35984具有协同作用的药物组合为解毒化瘀方和左氧氟沙星,两药联用FICI值为0.25,即1/8MIC左氧氟沙星(0.06ug/ml)+1/8MIC解毒化瘀方(3.9mg/ml),两药联用效果最好;对生物膜阴性菌ATCC12228具有协同作用的药物组合为解毒化瘀方和万古霉素,两药联用FICI值为0.375,即1/8MIC万古霉素(0.24 ug/ml)+1/4MIC解毒化瘀方(7.9mg/ml),两药联用效果最好。对于生物膜形成阳性菌株及生物膜形成阴性菌株,联用药物组效果均好于单药组。2、生物膜形成过程中,在6h细菌黏附阶段,1/8MIC左氧氟沙星(0.06ug/ml)和1/8MIC解毒化瘀方(3.9mg/ml)联合使用能明显抑制细菌在钛表面的粘附,相对于其他组,可见散在的细菌菌落聚集;在24h细菌聚集阶段,1/8MIC左氧氟沙星(0.06ug/ml)和 1/8MIC解毒化瘀方(3.9mg/ml)联合使用有明显的抑菌作用,其可以减少生物膜胞外基质的形成,破坏SE生物膜的微观结构,抑制生物膜的形成,且随着药物作用时间的延长,其抑菌性更明显。对于生物膜阳性菌ATCC35984来讲,联合用药组的抑制作用强于1/8MIC左氧氟沙星和1/8MIC解毒化瘀方单药组;对于生物膜阴性菌ATCC12228来讲,联合用药组的抑菌作用强于1/8MIC万古霉素和1/4MIC解毒化瘀方单药组。两菌相比,联合用药组对于ATCC12228的抑制作用要强于ATCC35984。3、在48h生物膜成熟阶段,1/8MIC左氧氟沙星(0.06ug/ml)和1/8MIC解毒化瘀方(3.9mg/ml)联合使用可以明显的破坏SE生物膜,并且杀灭膜内细菌。对于生物膜阳性菌ATCC35984来讲,联合用药组的杀菌作用强于1/8MIC左氧氟沙星和1/8MIC解毒化瘀方单药组;对于生物膜阴性菌ATCC12228来讲,联合用药组的杀菌作用强于 1/8MIC万古霉素和1/4MIC解毒化瘀方单药组。两菌相比,联合用药组对于ATCC12228的杀灭作用要强于ATCC35984。结论:1、在生物膜成熟之前,1/8MIC左氧氟沙星(0.06ug/ml)和1/8MIC解毒化瘀方(3.9mg/ml)联合使用可以较好的抑制生物膜的形成,且比两药单独使用抑菌作用更强。在6h阶段和24h阶段各组细菌数量也在增加,提示随着生物膜的形成,细菌的抗药性也在不断增强。2、在生物膜成熟后,1/8MIC左氧氟沙星(0.06ug/ml)和1/8MIC解毒化瘀方(3.9mg/ml)联合使用能对SE生物膜有较强的破坏作用,两药联用可以进入生物膜杀灭其中的SE。