【摘 要】
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背景胶质瘤是一类常见的神经系统恶性肿瘤。本病患者预后不良,目前的治疗方法主要是手术联合放疗和化疗,效果仍不令人满意。寻找新的诊断和治疗方法具有重要的临床实际价值。随着科学家们的不断探索,生物治疗、靶向治疗、免疫治疗等新治疗方法的出现,给一部分难治性肿瘤的治愈带来了希望。作为生物体一种重要的转录因子,DNA结合抑制因子2（Inhibitor of DNA binding 2或Inhibitor of
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背景胶质瘤是一类常见的神经系统恶性肿瘤。本病患者预后不良,目前的治疗方法主要是手术联合放疗和化疗,效果仍不令人满意。寻找新的诊断和治疗方法具有重要的临床实际价值。随着科学家们的不断探索,生物治疗、靶向治疗、免疫治疗等新治疗方法的出现,给一部分难治性肿瘤的治愈带来了希望。作为生物体一种重要的转录因子,DNA结合抑制因子2（Inhibitor of DNA binding 2或Inhibitor of differentiation 2,ID2）与胶质瘤的发生发展密切相关。目前,已有科学家提出了以ID蛋白为靶点进行抗癌药物研发的策略。本课题,我们利用一种成熟的基于配体的虚拟筛选技术开发了一种新型ID2小分子抑制剂,并揭示了其有效的抗胶质瘤作用。目的利用基于配体的虚拟筛选技术开发针对ID2蛋白的小分子抑制剂,并评估其对神经胶质瘤的抑制作用。方法1.目标化合物的筛选与鉴定（1）用计算机软件建立特定的药效团模型,进行化合物虚拟筛选。（2）CCK8法检测小分子化合物对人和小鼠胶质瘤细胞的半数抑制浓度,评估目标化合物对正常细胞的杀伤能力。（3）表面等离子共振（Surface plasmon resonance technology,SPR）技术检测目标化合物与ID2蛋白的亲和力。2.AK-778-XXMU在体外对胶质瘤细胞恶性行为的抑制作用（1）利用划痕实验和Transwell实验检测AK-778-XXMU对胶质瘤细胞迁移能力和侵袭能力的影响。（2）流式细胞术检测AK-778-XXMU是否能诱导胶质瘤细胞凋亡。（3）通过蛋白质免疫印迹实验（Western blot,WB）和实时荧光定量聚合酶链式反应（Quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR）检测AK-778-XXMU对胶质瘤细胞ID2-KDR信号通路的影响。3.AK-778-XXMU在体内对胶质瘤的抑制作用（1）将胶质瘤细胞U87接种于10只重度免疫缺陷小鼠腋下,并随机分为两组,分别腹腔注射二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide,DMSO）或AK-778-XXMU。（2）取两组小鼠的腋下瘤块拍照、称重进行比较。利用免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）技术分析两组肿瘤组织相关基因的表达情况。（3）对两组小鼠的各种脏器进行苏木素-伊红染色（Hematoxylin-eosin staining,HE）,评估目标化合物的毒副作用。结果1.目标化合物的筛选与鉴定（1）利用计算机虚拟筛选得到16个命中化合物,从上海陶术生物科技有限公司购买了这16个化合物。（2）CCK8实验结果表明:化合物AK-778/43465022和AK-778/43420895能够在低微摩尔浓度下有效抑制胶质瘤细胞的活力。但后者有较好的水溶性,且对正常细胞几乎无毒副作用,因此被确定为目标化合物,命名为AK-778-XXMU。（3）SPR结果证实AK-778-XXMU能与ID2蛋白高亲和力结合。2.AK-778-XXMU在体外对胶质瘤细胞恶性行为的抑制作用（1）划痕实验和Transwell实验结果表明:AK-778-XXMU能显著抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭。（2）流式细胞术结果显示:AK-778-XXMU处理U87和GL261 24 h后,AnnexinⅤ阳性的细胞百分率明显增加。（3）WB和q RT-PCR结果显示:AK-778-XXMU能显著抑制胶质瘤细胞ID2-KDR信号通路。3.AK-778-XXMU在体内对胶质瘤的抑制作用（1）体内实验结果显示:AK-778-XXMU能显著减慢小鼠腋下胶质瘤的生长,且实验期间两组小鼠的体重没有明显变化。（2）IHC结果显示:与对照组相比,治疗组的瘤块中Ki67和CD31阳性率显著降低。（3）HE染色结果表明治疗组心、肝、肺、肾的形态与对照组无明显差异。结论本课题,我们利用基于配体的药效团建模技术,通过虚拟筛选获得了小分子化合物AK-778-XXMU。它被证明是一种有效的ID2抑制剂,能够与ID2高亲和力结合,在体内和体外发挥抗胶质瘤的作用。
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