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巴尔通体(Bartonella species)是一群革兰氏染色阴性、营养条件要求苛刻、兼性细胞内寄生的需氧杆菌,分类学位置属于变形菌纲(Proteobacteria)、α亚群(Alpha proteobacteria)、根瘤菌目(Rhizobiales)。目前,巴尔通体属包括21个已命名种及一些待命名的新种,地理分布广泛,宿主动物种类繁多,涉及多种媒介生物,其中已知7种可致人类疾病,疾病谱广泛、临床表现复杂、诊断困难,20世纪90年代后,国外一些研究机构及传染病控制部门越来越重视对这种致病微生物研究。对于这样一种重要的人兽共患病病原体,目前我国还缺乏对其分布状况、宿主动物、媒介生物种类、人群流行病学等方面的研究资料,仅有从云南鼠类宿主中分离到巴尔通体的2次报道。为在我国开展巴尔通体研究工作,本研究以PCR技术为基础,应用克隆、测序及序列分析等分子生物学、生物信息学手段建立高敏感性、特异性巴尔通体检测方法,并对临床样本、鼠形宿主动物及潜在的传播媒介样本进行巴尔通体病原的分离培养、PCR检测鉴定、PCR产物测序及序列分析等研究。
获得了以下结果:
1.以PCR为基础的巴尔通体检测方法建立根据巴尔通体16S-23S rRNAITS序列中tRNA和tRNA编码基因在巴尔通体属内完全保守,tRNA-tRNA基因间隔区核酸序列具有高度变异特征,设计引物Tile.455p-TAla.885n。这对引物能够在属水平特异扩增巴尔通体目的基因,并且可以通过观察电泳图上扩增带大小,在一定程度上区别不同种或型巴尔通体。
应用3对巴尔通体属特异性引物TIle.455p-TAla.885n、Bh.31lp-Bh.452n及BhCS.781p-BhCS.1137n,从1例疑似猫抓病(cat-scratch disease,CSD)患者全血DNA中检出巴尔通体tRNA-tRNA基因间隔区、16S-23S rRNA ITS的5'-端序列及部分柠檬酸合成酶基因(citrate synthase gene,gltA),并经序列测定结果进一步证实为巴尔通体基因,在我国首次明确获得人类巴尔通体感染的分子病原学证据。
用引物16SF-23S1进行PCR反应扩增分离自黄胸鼠(Rattus tanezumiflavipectus)血液的菌株RT222SM,将扩增产物克隆,挑选阳性克隆子测序获得16S-23S rRNA ITS全长序列,用同源性基因搜索及比较方法分析确定其基因结构:通过多序列比对、序列同源性比较及种系发育分析,初步推断这株巴尔通体基因型与已知巴尔通体不同。RT222SM的tRNA-tRNA基因间隔区与我们检测的临床样本对应序列完全一致,提示这一基因型具有致病的潜在可能性。
2.鼠形动物巴尔通体感染情况
在云南捕捉鼠形动物等巴尔通体可能的贮存宿主,取全血分离培养巴尔通体,共检获阳性菌株69株。从云南西南部3种不同气候类型共4个地区捕获的黄胸鼠、褐家鼠、大绒鼠和锡金小鼠4种家、野鼠种中分离到了巴尔通体,其中锡金小鼠为首次发现的带菌鼠种,总分离率达39.2%,鼠种的感染率为66.7%。再次证实巴尔通体在云南鼠类宿主动物中高度流行,并具有对不同地理和气候环境广泛的适应能力及宿主多样性特征。
3.蚤、蜱巴尔通体分离培养及检测鉴定
从狗体表寄生的猫栉首蚤(Ctenocephalides felis)及牛体表的微小牛蜱(Boophilus microplus)中分离培养出巴尔通体,测序及序列分析发现猫栉首蚤分离的巴尔通体与RT222SM基因型同源性最大;微小牛蜱分离的巴尔通体经gltA基因核酸序列系统发育分析显示,与中国云南分离的巴尔通体亲缘关系较近,而与国外已知巴尔通体亲缘关系较远。
本研究用3对巴尔通体属特异性引物直接PCR扩增未经培养的猫、鼠等体表寄生蚤,再次在猫栉首蚤中发现巴尔通体基因证据;在另外一种鼠蚤(缓慢细蚤Leptopsylla segnis)中也扩增出巴尔通体基因片段,首次证实这种重要蚤类媒介可以携带巴尔通体。
本研究再次证实巴尔通体在我国南方鼠群中高度流行,并为蚤、蜱作为巴尔通体传播媒介提供了线索,还发现我国可能存在一种新的存在于鼠、猫、狗宿主动物中的致病性巴尔通体,并再次证实我国巴尔通体基因型具有多样性特征。巴尔通体检测方法及分离培养技术的建立为今后进一步开展巴尔通体流行病学、病原学及致病机理等方面的研究打下了良好的基础。