论文部分内容阅读
目的：观察三肽化合物酪丝缬肽(YSV)的抗肝癌作用，初步探讨其下调肝癌细胞组蛋白表达，抑制肿瘤细胞增殖，诱导死亡的机制。方法：1．应用MTS法和中空纤维测定法观察YSV对五种人肝癌细胞BEL-7402、SMMC-7721、Hep3B、Hep G2、SK-HEP-1和两种人正常肝细胞株Chang liver、HL-7702和正常人淋巴细胞在体外、体内生长的作用；建立人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤模型，观察YSV对裸鼠移植瘤生长的抑制作用，应用透射电镜观察YSV对BEL-7402裸鼠移植瘤细胞超微结构的影响。2．应用流式细胞术观察YSV对体外人肝癌BEL-7402细胞的细胞周期的影响；应用Annexin V／PI双染色法、DNA片段化检测和Nucleosome ELISA方法观察YSV对体外人肝癌BEL-7402细胞的凋亡诱导作用。3．应用RT-PCR和Western blot方法观察YSV对体内人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤组织、荷瘤鼠正常肝组织；体外培养人肝癌细胞BEL-7402、Hep G2和正常人肝细胞HL-7702、正常人淋巴细胞的五种组蛋白H1、H2A、H2B、H3和H4表达的影响。4．应用Nuclear Run-on Assay观察YSV对人肝癌BEL-7402细胞的五种组蛋白转录效率的影响；应用放线菌素D转录抑制法观察YSV对组蛋白mRNA半衰期的影响；应用Western blot检测SLBP的表达水平观察YSV对组蛋白mRNA加工的影响。5．应用流式细胞术检测H2A.X磷酸化以观察YSV诱导人肝癌BEL-7402细胞的DNA损伤作用；应用Giemsa染色观察YSV对人肝癌BEL-7402细胞染色体结构的影响；应用磷酸化组蛋白H3／PI双染法观察YSV对人肝癌BEL-7402细胞有丝分裂的影响。结果：1．YSV在体外(0.2、0.4、0.8、1.6mg／ml)和体内(160、320μg／kg／d)均能明显抑制上述五种肝癌细胞株的生长(P＜0.05)，对正常人肝细胞和正常人淋巴细胞的生长无明显影响(P＞0.05)。组成YSV的三种氨基酸等摩尔比混合物对上述人肝癌细胞均无明显抑制作用，提示YSV的抗肿瘤作用与其独特的小分子多肽结构有关。YSV(320、640μg／kg／d)能够明显抑制人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤的生长(P＜0.05)。超微结构研究显示，YSV(320μg／kg／d)诱导人肝癌BEL-7402细胞的染色质溶解、固缩，细胞器的普遍崩解，细胞出现凋亡和坏死。2．YSV(0.8mg／ml)能够阻抑体外人肝癌BEL-7402细胞的细胞周期进程，诱导S期阻滞，减少G2／M期细胞百分比。YSV(0.8mg／ml)能够诱导体外人肝癌BEL-7402细胞凋亡和坏死，增加凋亡细胞百分比，诱导DNA片断化，增加凋亡性游离核小体的数量(P＜0.05)。3．YSV明显抑制人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤组织、体外人肝癌细胞BEL-7402、Hep G2细胞的五种组蛋白的mRNA和蛋白的表达(P＜0.05)。YSV对荷瘤鼠正常肝组织，正常人肝细胞HL-7702和正常人淋巴细胞的组蛋白的表达无明显影响。4．YSV(0.8mg／ml)明显降低人肝癌BEL-7402细胞的组蛋白H3的转录效率；缩短组蛋白H2B、H3、H4的mRNA半衰期；明显抑制SLBP的表达，影响组蛋白mRNA加工过程。5．YSV(0.8mg／ml)诱导人肝癌BEL-7402细胞的DNA损伤和染色体的破坏，下调有丝分裂标志物磷酸化组蛋白H3的阳性细胞的百分比，抑制肿瘤细胞有丝分裂。结论：YSV能够明显抑制肝癌细胞的生长，阻抑肿瘤细胞的细胞周期，诱导凋亡和坏死。对正常细胞未见明显影响。其可能的作用机制是通过抑制肿瘤细胞组蛋白的合成而减少组蛋白的表达，引起DNA损伤和染色体的破坏，诱导细胞死亡。同时组蛋白表达下降激活S期检查点，诱导S期阻滞，抑制细胞分裂增殖。