研究背景高血压是心血管疾病最重要的危险因素,而血管重塑是导致高血压患者心血管事件发生率显著增加的独立危险因素。与高血压相伴随的血管结构和功能的改变即高血压血管重塑,主要包括管壁增厚、管壁管腔比值增大和小血管减少,以及随之产生的血管功能异常。血管重塑不仅仅是一种代偿反应,也是高血压的主要病理基础之一,是引起高血压各种严重并发症以及循环系统功能紊乱的重要原因。血管重塑可导致一系列的临床事件,如高血压、动脉粥样硬化和血管狭窄等。目前的研究表明,高血压主动脉重塑是死亡率增加的主要原因之一。因此预防和改善血管重塑也是高血压治疗的主要目标之一和评价高血压治疗效果的重要指标。血管重塑的发病机制和防治措施已成为国内外的研究热点。高血压血管重塑是一个非常复杂的病理过程,其确切的机制仍不十分明确。研究发现,血管重塑涉及多个细胞过程的变化,如细胞肥大、增殖、调亡、重塑、炎症反应、氧化应激、细胞因子的活化、细胞外基质产生与降解等。高血压主动脉重塑的中心环节是因血管平滑肌细胞肥大导致的血管中膜增厚。蛋白激酶D(PKD)家族是一种新发现的Ca2+/钙调蛋白依赖性的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,主要包括PKD1、PKD2, PKD3三个成员。PKD结构与酶的活性均和PKC家族不同。越来越多的证据表明,PKD介导的信号通路在心血管系统中发挥重要作用,尤其在调节心肌收缩、心室肥厚及重塑中的作用。最近的研究显示血管平滑肌细胞也表达PKD,且PKD的活性能被一些刺激因素激活,如血管紧张素Ⅱ,血小板源性生长因子和血栓素等。用血管紧张素Ⅱ刺激血管平滑肌细胞时,PKD通过AT1/PKCδ途经被激活。另外有研究证实PKD可通过使组蛋白去乙酰酶5(HDAC5)磷酸化介导血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞肥大。然而,PKD在自发性高血压大鼠主动脉组织中的活性表达及其在主动脉重塑中的作用机制还不是很明确。高血压患者经常伴随血脂代谢紊乱,因此他汀类药物在高血压患者中应用广泛。越来越多的证据表明,他汀类药物除了能够有效降低血脂水平外,还能发挥其降脂以外的多项心血管保护效应,如：改善血管内皮功能、稳定动脉粥样硬化斑块、抗炎抗氧化以及阻止心室肥厚、改善心室重塑等。无论患者血脂是否正常,应用他汀类药物均能降低心血管疾病的致残率和死亡率。最近的研究表明,阿托伐他汀能抑制心肌肥厚及纤维化。然而,它在血管重塑中的保护作用及其具体机制还不是很清楚。本课题动态观察高血压大鼠主动脉组织中PKD表达和活化特点及其与主动脉重塑的关系；研究PKD在高血压主动脉重塑中的作用机制；初步探讨阿托伐他汀对高血压主动脉重塑的改善作用及其分子机制。旨在从分子角度阐明高血压血管重塑的发病机制和他汀类药物改善血管重塑的机制。为高血压血管重塑的防治提供新思路和理论依据。目的1.进一步明确自发性高血压大鼠主动脉重塑的发生发展过程；2.探讨自发性高血压大鼠主动脉组织中蛋白激酶D的活性表达在血管重塑中的作用。3.评价阿托伐他汀在改善高血压主动脉重塑发生发展中的作用及与PKD的关系。方法8周龄WKY大鼠40只、自发性高血压(SHR)大鼠50只。WKY大鼠随机分为四组,A组：8周龄(n=10只)；B组：16周龄(n=10只)；C组：24周龄(n=10只),G组：WKY安慰剂(n=10只)。SHR大鼠随机分为五组：D组：8周龄(n=10只)；E组：16周龄(n=10只)；F组：24周龄(n=10只)；H组：SHR安慰剂(n=10只)；Ⅰ组：SHR阿托伐他汀(ATV)50mg·kg-1·d-1 (n=10只)。以标准大鼠饲料喂养及普通饮水。另外,WKY安慰剂组、SHR安慰剂组及SHR阿托伐他汀治疗组,自16周龄开始每天以蒸馏水或阿托伐他汀分别灌胃,持续8周。于8、16、24周处死动物,留取胸主动脉组织标本备用。实验过程中,进行以下检测：(1)各组大鼠每隔2周测量体重、心率及尾动脉血压一次；(2)分别于喂养前、喂养至16周、24周抽血测定空腹血脂；(3) HE、Masson及天狼腥红染色,观察主动脉壁内膜结构、中膜厚度、弹力纤维和胶原沉积变化；(4)测量主动脉壁中层厚度(MT)、内径(LD)、胶原体积分数(VFC),并计算MT/LD比值；(5)计算羟脯氨酸含量；(6) ELISA法检测炎症因子IL-6和TNF-α; (7) Western blot法检测硝基酪氨酸、PKD、p-PKD744/748、p-PKD916蛋白的表达。结果1.实验动物基本情况实验过程中共有2只大鼠死亡,SHR大鼠组16及24周龄组各一只。在普通喂养周期内死亡。SHR阿托伐他汀治疗组无死亡。共88只大鼠完成实验,其中WKY组40只,SHR组48只。2.各组大鼠基本指标比较喂养前,各组大鼠心率、血脂均无显著差异(P>0.05)；SHR大鼠尾动脉收缩压高于WKY大鼠,差异显著(P<0.05)。WKY大鼠的血压在整个喂养过程中无明显升高,与WKY组比较,SHR大鼠血压随周龄逐渐升高,差异有显著性意义(P<0.05)；SHR阿托伐他汀治疗组尾动脉收缩压明显降低,有显著性差异(P<0.05)实验前各组大鼠血甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)间差异无显著性统计学意义(P>0.05)。SHR阿托伐他汀组血清TC及LDL均较WKY安慰剂、SHR安慰剂组明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),TG和HDL-C变化不明显(P>0.05)。3.主动脉形态及组织病理观察HE染色显示：WKY大鼠血管壁无明显增厚,平滑肌细胞体积较小,大小均一,排列整齐,中膜层弹力纤维排列有序,内膜均一,无增厚；SHR大鼠中膜明显增厚,中膜内平滑肌细胞肥大,形态不规则,排列紊乱,弹力纤维层扭曲,内皮细胞排列紊乱,内膜略有增厚,部分内皮细胞有脱落。随着周龄的增加,上述表现愈加明显。阿托伐他汀组与SHR安慰剂组相比较,内、中膜结构均明显改善,内膜较平滑均一,中膜增厚明显减弱,平滑肌细胞肥大减退,排列较规则,中层弹力纤维结构较完整有序。Masson染色显示：WKY组弹力纤维排列整齐,胶原增生不明显；SHR组胶原纤维明显增多,弹力纤维减少、排列紊乱甚至断裂；阿托伐他汀组与SHR安慰剂组相比较,胶原增生减少,弹力层增多,排列较整齐。天狼腥红染色显示：与WKY对照组相比,SHR组随着周龄增加,Ⅰ型胶原纤维和Ⅲ型胶原显著增加,阿托伐他汀组比SHR安慰剂组胶原纤维明显减少。4.主动脉重塑相关指标变化与WKY组比较,SHR组MT、MT/LD、VFC均显著增加(P<0.05)；阿托伐他汀组较SHR安慰剂组MT、MT/LD、VFC显著降低(P<0.05)。5.羟脯氨酸含量变化WKY大鼠在整个喂养过程中,羟脯氨酸含量无明显增加。与WKY组比较,SHR组羟脯氨酸随周龄显著增加(P<0.05)；阿托伐他汀组较SHR安慰剂组羟脯氨酸显著降低(P<0.05)。6.炎症因子表达变化与WKY组比较,SHR组IL-6和TNF-α均显著增加(P<0.05)；阿托伐他汀可明显降低IL-6和TNF-α(P<0.05)。7.氧化应激硝基酪氨酸是氧化应激的标志物,与WKY组相比,SHR组硝基酪氨酸表达明显增加(P<0.05)；阿托伐他汀可明显降低硝基酪氨酸表达(P<0.05)。8. Westen blot检测各组主动脉组织中PKD及磷酸化PKD的表达与同周龄WKY对照组相比,SHR8、16.24周龄组大鼠主动脉组织中p-PKD744/748、p-PKD916表达明显升高(P<0.05)；随着周龄的增加SHR组p-PKD744/748、p-PKD916表达水平逐渐升高(P<0.05)。同期WKY各组大鼠的P-PKD744/748、p-PKD916没有显著性变化。SHR阿托伐他汀组P-PKD744/748. P-PKD916较SHR安慰剂组的表达减弱,有统计学意义(P<0.05)。SHR各组总的PKD表达无明显变化。结论1.SHR大鼠随着喂养时间延长呈增龄性主动脉重塑,为高血压主动脉重塑发病机制的研究提供了可靠的动物模型平台。2.SHR大鼠主动脉组织中磷酸化PKD的表达随着主动脉重塑过程逐渐升高,提示磷酸化PKD参与了自发性高血压大鼠主动脉重塑的发生发展过程。3.阿托伐他汀可以改善自发性高血压大鼠主动脉重塑的发展,这与其抗炎抗氧化特性有关,其作用靶点可能与PKD有关。研究背景高血压状态下,大小动脉的结构和功能都会发生变化,从而引起血管重塑及心血管疾病的危险性增加。血管壁中膜增厚是高血压主动脉重塑最重要的特征性病理改变,其主要形成原因是管壁中层血管平滑肌细胞的肥大。高血压血管肥厚和重塑是对病理状态下血流动力学长期变化的一种代偿反应。高血压血管肥厚包含的细胞分子学过程有：VSMC肥大、增殖、迁移、凋亡、炎症反应、氧化应激和纤维化。肾素血管紧张素系统(RAS)在高血压和心血管疾病的发生发展过程中发挥重要作用。实验证据证明,在高血压血管重塑的发生发展过程中,伴随着血管局部RAS的激活和血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)的高水平表达。RAS的中心环节是AngⅡ识别其特异性受体,并通过一定的信号通路发挥作用。作为RAS系统的主要效应因子,AngⅡ是高血压心血管重塑的重要调节因子。AngⅡ是一种血管活性肽,通过升高血压引起血管重塑和内皮功能紊乱。然而,AngⅡ还可以通过不依赖血流动力学的作用介导血管重塑。大量的证据表明,AngⅡ通过刺激VSMC肥大而诱导病理性的血管重塑。AngⅡ还参与血管纤维化,通过TGF-β依赖性和非依赖性Smad通路引起血管纤维化。另外,AngⅡ是血管组织中ROS和促炎转录因子的主要调节因子。ERK5是最近发现的MAPK家族的新成员,在不同类型细胞中的定位不同。多种刺激因素,如神经生长因子,表皮生长因子,血小板源性生长因子和血管紧张素Ⅱ都能激活ERK5。ERK5在将信号从细胞膜传递到细胞核的过程中激活了一个三级级联反应：MAPKKK或MEKK2/MEKK3; MAPKK或MEK5; MAPK或ERK5,受到刺激后,这些激酶持续磷酸化并活化下游的效应因子,包括肌细胞增强因子(MEF2)。ERK5在调节肥厚相关基因,尤其是MEF2依赖的c-jun基因方面有潜在作用,通过直接磷酸化MEF2使其活化,从而调节肥大反应。ERK5在AngⅡ刺激的大鼠主动脉平滑肌细胞中可激活下游的MEF2。PKD作为肥厚调节因子,参与心脏与血管的肥厚性重塑。PKD对MAPK家族信号通路具有调节作用,如PKD通过磷酸化Ras结合蛋白RIN1而上调Ras和ERK1/2信号通路的活性；通过磷酸化c-Jun而下调JNK的活性。但是关于PKD对ERK5是否有调节作用,目前尚无相关研究。因此,本实验将进行体外AngⅡ诱导人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)肥大实验,验证PKD/ERK5/MEF2信号通路是否参与其中,从而为高血压血管重塑的逆转提供新的治疗靶点。研究目的1.验证AngⅡ诱导人主动脉血管平滑肌细胞(HASMCs)肥大的作用；2.明确AT1/PKCδ/PKD/ERK5/MEF2信号转导通路在Angll诱导HASMCs肥大中的作用机制；研究方法1.人主动脉血管平滑肌细胞的体外培养HASMCs购自ScienCell (San Diego, CA)公司,在MEM培养基,37℃和5%CO2中培养,取代数在4-8,处于生长对数期的细胞进行实验。4细胞分组处理1)无刺激因素孵育细胞；2) AngⅡ刺激细胞,筛选最佳刺激浓度和时间；3) AngⅡ刺激+DMSO孵育细胞；4) AngⅡ刺激+AT1拮抗剂Losartan孵育细胞；5) AngⅡ刺激+AT2拮抗剂PD123319孵育细胞；6) AngⅡ刺激+PKC抑制剂Go6983孵育细胞；7) AngⅡ刺激+Control siRNA孵育细胞；8) AngⅡ刺激+PKCδsiRNA孵育细胞；9) AngⅡ刺激+PKD siRNA孵育细胞；10) AngⅡ刺激+ERK5 siRNA孵育细胞。3.对各组HASMCs进行如下检测：1)电镜观察细胞形态学改变；2)3H-亮氨酸摄入率测定,评估细胞肥大的程度；3) Western blot测定PKC, p-PKCα/β,ζ,ε,δ, PKD、p-PKD744/748、P-PKD916、ERK1/2、p-ERK 1/2、ERK5、p-ERK5、MEF2C、p-MEF2C的表达,用特异性的抑制剂或si RNA阻断通路的各环节,观察下游分子的表达变化；4)免疫荧光测定各分子的表达及ERK5在胞浆胞核之间的转位。研究结果1.AngⅡ刺激HASMCs的形态学变化AngⅡ刺激组：加AngⅡ(以无血清培养液溶解)使终浓度为100nM；正常对照组(control):培养液中加等量无血清培养液。处理一定时间后在显微镜下观察细胞形态学变化。镜下观察可见在加用AngⅡ刺激后,HASMCs较正常对照组表现明显肥大。2. AngⅡ刺激的HASMCs 3H—亮氨酸掺入率的测定一定浓度的AngⅡ(100nM)刺激不同时间(0min、5min、15min、30min、60min),15分钟后HASMCs 3H-亮氨酸掺入较空白组明显增高(P<0.01)。当时间恒定时(15min),HASMCs 3H-亮氨酸掺入随着AngⅡ浓度(1nM、10nM、100nM、1000 nM)的增加呈剂量依赖性增加,后三组明显高于对照组,差异非常显著(P<0.01)。3. Western blot测定AT1/PKCδ/PKD/ERK5/MEF2C信号通路1) AngⅡ刺激HASMCs后,PKC不同亚型的激活AngⅡ100nM不同时间(0、5、15、30、60min)刺激平滑肌细胞,观察不同亚型PKC磷酸化蛋白的表达,结果发现磷酸化PKCδ在5分钟时开始表达,15到30min达到表达高峰,以后则呈逐渐下降趋势,60min时表达恢复基线水平。PKCa/p和PKCε表达随时间无明显变化,PKCζ则在30min时开始表达,60min时表达有所增加。2) AngⅡ对HASMs中ERK1/2和ERK5的激活AngⅡ100nM不同时间(0、5、15、30、60min)刺激平滑肌细胞,观察ERK1/2、ERK5总蛋白及磷酸化蛋白的表达,结果发现磷酸化ERK5在5分钟时开始表达,15到30min达到表达高峰,以后则呈逐渐下降趋势,60min时表达恢复基线水平。磷酸化ERK1/2表达较早,5min表达达高峰,较0、15、30、60min有显著性差异(p<0.01)。ERK1/2、ERK5总蛋白表达在各时间段没有变化。3)AngⅡ通过AT1激活ERK5AngⅡ受体有两个亚型AT1、AT2。应用ATl特异性拮抗剂Losartan(0.3、1.0、3.0μmol/L)及AT2特异性拮抗剂PD123319(5、10、20μmol/L)预处理平滑肌细胞30min,然后AngⅡ100nM刺激15min,结果显示Losartan剂量依赖性阻断p-ERK5的表达,而PD123319对p-ERK5的表达没有影响。4)AngⅡ激活ERK5依赖于PKCδ通路应用PKC的抑制剂Go6983不同浓度(0.3、1、3μmol/L)预处理平滑肌细胞30min,AngⅡ100nM刺激15min,结果显示Go6983呈剂量依赖性抑制磷酸化ERK5的表达,由此证明PKC参与AngⅡ激活ERK5的过程。用PKC8 siRNA预处理细胞后,再加入AngⅡ刺激,ERK5的磷酸化明显受到抑制,说明PKCδ是ERK5的上游分子。5)AngⅡ介导的PKD激活呈AT1/PKCδ依赖性AngⅡ诱导的PKD活化呈时间和浓度依赖性。AT1受体拮抗剂Losartan 3mmol/L阻断p-PKD的表达,而AT2受体拮抗剂PD123319 10mmol/L对p-PKD的表达没有影响；PKC抑制剂Go6983呈剂量依赖性抑制磷酸化PKD的表达；PKCδsiRNA明显抑制PKD的活化。由此证明AT1/PKCδ参与AngⅡ激活PKD的过程。6)PKD参与AngⅡ介导的ERK5的激活应用PKD siRNA转染HASMCs,观察下游分子ERK5的表达。结果显示：PKD siRNA抑制p-ERK5的表达,与对照组有显著性差异(P<0.01)。7)PKCδ/PKD/ERK5参与了AngⅡ介导的MEF2C的激活AngⅡ100nM不同时间(0、5、15、30、60min)刺激HASMCs,观察MEF2C的激活。结果显示：磷酸化MEF2C在5分钟时开始表达,15min达到表达高峰(p<0.01),30min表达恢复基线水平。PKC抑制剂、PKCδsiRNA、PKD siRNA、ERK5 siRNA显著减少磷酸化MEF2C的表达(p<0.01)。8) PKCδ/PKD/ERK5参与了Angll介导的HASMCs肥大AngⅡ100nM刺激15分钟,HASMCs 3H-亮氨酸摄入率明显增加(p<0.01)；PKC抑制剂、PKCδsiRNA、PKD siRNA、ERK5 siRNA显著降低3H-亮氨酸摄入率(p<0.01)。4.免疫荧光1)免疫荧光测定各分子的表达用免疫荧光细胞化学染色观察AngⅡ100nM刺激不同时间后HASMCs PKD、ERK5和MEF2C的表达。结果显示：PKD胞质表达,MEF2C胞核表达,而ERK5随着刺激时间不同在胞浆和胞核之间转位。2)ERK5胞浆胞核之间的转位静息状态下,ERK5位于细胞质中,AngⅡ100nM刺激5分钟后,ERK5逐渐向细胞核转位,15分钟时基本全部位于胞核内,随后ERK5又重新向细胞质转移,在1小时时基本恢复基线水平。3) AT1/PKCδ/PKD信号通路参与了Angll介导的ERK5转位AngⅡ100nM刺激15分钟后,ERK5的细胞核表达水平达最高。分别应用AT1受体拮抗剂,PKC抑制剂、PKCδsiRNA和PKD siRNA干扰细胞,阻断ERK5的磷酸化,ERK5的转位明显被抑制,提示ERK5的转位依赖于其磷酸化情况。结论1.验证了AngⅡ具有诱导HASMCs肥大的作用；2.首次证明AT1/PKCδ/PKD/ERK5/MEF2C信号通路参与AngⅡ诱导的HASMCs肥大的过程。