【摘 要】
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S-扁桃酸是合成手性药物及精细化工领域的重要中间体,可通过外消旋扁桃酸经手性拆分获得。生物酶法手性拆分具有立体专一性强、反应温和、耗能少、成本低、对环境污染小等优
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S-扁桃酸是合成手性药物及精细化工领域的重要中间体,可通过外消旋扁桃酸经手性拆分获得。生物酶法手性拆分具有立体专一性强、反应温和、耗能少、成本低、对环境污染小等优点,手性单一的氧化还原酶常被用来拆分外消旋化合物。以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD~+)作为辅因子的R-扁桃酸脱氢酶(RMDH)专一催化R-扁桃酸(R-MA)生成苯乙酮酸,可以用来拆分外消旋扁桃酸获得手性S-扁桃酸(S-MA)。本研究旨在获得纯化的RMDH,并对RMDH的酶学性质进行研究；同时,通过酶偶联法实现RMDH辅因子NAD~+的再生,为生产S-MA打下研究基础。从土壤中筛选得到一株产RMDH的细菌,通过16s rDNA序列分析和对菌体的透射电镜观察,该菌株被鉴定为Pseudomonas putida。该菌为杆菌,长约1.7-2.3μm,宽约0.6-0.9μm,有极生鞭毛。将液体培养获得的菌体通过超声破碎、硫酸铵盐析、疏水层析提取分离后得到纯化倍数11.0,比活力0.33 U/mg的MDH。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示纯化后的RMDH为单一条带,分子量为61 kDa。实验对RMDH的酶学性质进行了研究。RMDH在pH 7.6-pH 9.0酶活力较高,最适pH为8.5；在温度梯度20℃-40℃酶活力较高,最适温度为30℃。在最适条件下,RMDH对R-MA的Km值为2.0×10-2mM, kcat为0.9 s-1；对NAD~+的Km值为1.8×10-2mM,kcat为0.9 s-1；对NADP+的Km值为1.5×10-2mM,kcat为0.3 s-1。RMDH既可以用NAD~+作为辅因子,也可以用NADP+作为辅因子。以NAD~+作为辅因子时,RMDH的催化效率是以NADP+作为辅因子时的2.5倍。从土壤中筛选得到产NADH脱氢酶的野生菌株E.coli JZW506,发酵获得的菌体经过超声波破碎获得粗酶,粗酶经过硫酸铵盐析、DEAE-纤维素离子交换层析分离纯化,获得NADH脱氢酶。NADH脱氢酶在pH 5.6-pH 8.0酶活力较高,最适pH为7.6;在温度梯度25℃-60℃酶活力较高,其最适温度为45℃。在最适条件下,NADH脱氢酶对NADH的Km值为10.2μM。构建以NADH脱氢酶和漆酶双酶偶联系统为基础的NAD~+再生的方法,为NAD~+依赖型氧化还原酶的大规模应用提供研究基础。在NADH脱氢酶与漆酶总酶活1：1的情况下,双酶最佳偶联温度为30℃,最佳偶联pH为5.6。在此条件下,由0.5 U的NADH脱氢酶与0.5 U的漆酶组成的双酶系统,以0.1 mM的铁氰化钾作为电子传递介质,140rpm振荡反应,2h可催化转化10 mM(反应体系5 mL)的NADH生成NAD~+。实验同时对RMDH与NADH脱氢酶的偶联进行了研究,在两酶酶活力比为1：1的情况下,双酶偶联系统最适pH为7.0,最适反应温度为35℃。
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