艰难梭菌TcdB受体结合区域单克隆抗体的制备及初步应用

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艰难梭菌(Clostridium difficile,C.diff)是广泛存在于环境及各种动物体内,能够引起腹泻,伪膜性肠炎等疾病的条件致病菌,严重威胁人类健康和养殖业安全生产。而ST11型艰难梭菌目前是国际范围内流行最为广泛,危害最大的亚型之一。所以本研究旨在表达ST11型艰难梭菌Tcd B毒素蛋白受体结合区域(RBD),筛选针对ST11型Tcd B RBD的单克隆抗体,并利用该抗体初步建立用于检测ST11型艰难梭菌Tcd B毒素的双抗体夹心ELISA方法。首先,成功构建了能表达ST11型Tcd B rbd大肠杆菌。以大肠杆菌BL21(DE3)作为表达菌,p ET-32a(+)作为表达载体,将Tcd B RBD(1848bp)基因片段插入载体中,经终浓度为1m M的IPTG诱导4h后,重组大肠杆菌能够表达大小约为97KD左右的重组RBD蛋白。其次,成功筛选了能够分泌针对ST11型Tcd B RBD单克隆抗体的杂交瘤细胞。经重组RBD蛋白免疫后小鼠,抗体效价均达到了1:51200,通过杂交瘤技术,获得1株克隆化阳性的杂交瘤细胞AE2D3,亚型鉴定结果为Ig G2b(κ),采用辛酸-硫酸铵粗提和Protein G凝胶亲合层析法对腹水进行纯化,纯度在90%以上,浓度为0.743mg/ml,经Western blot验证为抗RBD特异性抗体。最后,成功建立了可用于检测ST11型艰难梭菌Tcd B毒素的双抗体夹心ELISA方法。最佳反应条件为0.05m M碳酸盐包被1:1600多抗37℃1h+4℃过夜孵育,3%脱脂牛奶37℃封闭1h,加入待检样品后加入AE2D3检测抗体0.23ug37℃孵育1h,最后加入HRP酶标二抗37℃孵育0.5h后显示10分钟读数。利用该方法检测临床分离ST11型艰难梭菌阳性率为100%,其他对照样本全为阴性。该检测方法具有很高的特异性和良好的敏感性。
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