甾醇药物是仅次于抗生素的第二大类药物,在治疗和预防各种疾病中起着重要作用。4-雄烯-3,17-二酮（AD）,1,4-雄二烯-3,17-二酮（ADD）,9α-羟基雄烯二酮（9-OHAD）,9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-1,4-二烯-3,20-二酮（Δ1,2-EP）等都是非常有价值的甾醇药物中间体,可用于生产多种激素类药物。分枝杆菌可以通过降解植物甾醇获得9-OHAD。为了构建高产9-OHAD的分枝杆菌菌株,我们分析了Mycobacterium neoaurum MS136菌株降解植物甾醇向9-OHAD转化过程中一些重要基因的表达响应。通过过表达对植物甾醇响应明显上调的基因（hsd,cyp125,fad D19,hsd4A和ksh）来检测其对9-OHAD产量的影响。最后,选择四个关键基因（hsd,hsd4A,ksh A1和ksh B）过表达,并敲除导致不利于9-OHAD积累的kstd基因构建重组Mycobacterium neoaurum MS136-F菌株。以13.0 g/L的商业植物甾醇（包括6.2 g/L的β-谷甾醇,3.0 g/L的菜油甾醇,3.3 g/L的豆甾醇和0.5 g/L的其他物质）为底物发酵,在发酵第108小时后获得了6.8 g/L的9-OHAD,是出发菌株M.neoaurum MS136（9-OHAD产量为4.7 g/L）的1.45倍。在植物甾醇原料中,β-谷甾醇和菜油甾醇均被完全降解并以98.5%的高摩尔转化率转化为9-OHAD,但豆甾醇降解困难,只有0.3g/L被菌株所利用。本研究还比较了15个组成型启动子和49个核糖体结合位点序列（RBS）在Mycobacterium neoaurum ATCC 25795中对基因表达的调控能力。验证了大肠杆菌来源的trp,trc,tac和tic启动子在分枝杆菌中调控基因表达的能力。确认了来自枯草芽孢杆菌的启动子pm2及截断pm2启动子后所获得的启动子pms,分枝杆菌弱启动子hsp70和十个串联启动子（CP1-10）在分枝杆菌中调控基因表达的能力。其中,串联启动子CP6调控基因表达的能力强于hsp60启动子。基于RBS预测软件和i GEM信息设计构建了一个含有49个RBS的文库,并检测了它们在分枝杆菌中调控基因的能力。RBS的文库含有38个强于对照RBS的序列和11个弱于对照RBS的序列。发现富含A/U碱基的RBS可以增加m RNA的稳定性和翻译效率。通过使用含有中等强度RBS序列（R1）和强启动子（CP6）的基因表达盒来驱动ksh基因过表达,可通过增强ksh基因表达使9-OHAD产量提高到5.72 g/L,是原始菌株（4.58 g/L）的1.24倍。此外,在利用中等强度RBS序列（R1）和强启动子（CP6）的基因表达盒来驱动hsd,hsd4A和ksh基因在M.neoaurum MS136菌株中的表达能力比原始的hsp60启动子和Mrbs序列强,能够明显缩短发酵的时间。甾醇C-1,2位脱氢是甾药生产中的一个重要反应,直接利用分枝杆菌进行脱氢反应存在易使产物形成不稳定结构、乙醇做促溶剂的耐受性低等缺点,因此我们选择酿酒酵母作为底盘细胞。3-酮类固醇-Δ1,2-脱氢酶（KSTD）在甾醇C-1,2位脱氢反应中起重要作用。KSTD是一种FAD辅酶,外源添加FAD可以提高酶催化反应效率,但是成本过高不利于工业生产。FAD合成途径的工程改造可以显著增加其胞内浓度并改善生物催化反应。此外,为了保证酶催化反应的持续性,维持其高效性,还需要实现FAD的循环再生。在这项研究中,我们将枯草芽孢杆菌中的FAD合成基因整合到酿酒酵母基因组中,用以提高胞内FAD含量,同时添加了甲酸脱氢酶和NADH氧化酶促进FAD再生。最后通过表达3-酮类固醇-Δ1,2-脱氢酶,成功构建了酿酒酵母甾醇C-1,2脱氢反应体系,使底物AD和9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-4-烯-3,20-二酮（EPA）的生物转化率有了明显提升。