古菌病毒相较于噬菌体和真核生物病毒,其突出特征在于形态的多样性,包括球状、杆状、丝状、酒瓶状、纺锤状、水滴状、头尾型等多种形态。古菌病毒基因组成、基因组结构以及其编码蛋白也呈现多样性。大多数病毒蛋白难以基于序列分析进行功能注释,这也暗示古菌病毒是未知基因和蛋白的丰富来源,具有重要的研究意义。腾冲硫化叶菌纺锤状病毒STSV2分离自云南腾冲热泉,其宿主为腾冲硫化叶菌（Sulfolobus tengcshongensi）,是一种温和病毒,不会引起宿主细胞裂解。病毒基因游离于宿主染色体之外,经全基因组测序分析,发现其含有75个开放阅读框架（Open reading frames,ORFs）,其中20个ORFs被预测具有潜在功能,其余ORFs功能未知。此外,STSV2中没有RNA聚合酶和基本转录因子（TBP、TFB）的编码序列,需借助宿主的转录系统完成自身转录。之前的一项研究中,研究人员从感染了 STSV2的宿主菌株中纯化出RNA聚合酶复合体,对其共纯化蛋白进行质谱检测,鉴定出九个病毒蛋白,其中的ORF2和ORF51被预测具有转录调控功能。本文围绕STSV2病毒蛋白ORF2和ORF51的功能进行了研究,希望为揭示STSV2病毒在感染过程中转录调节机制打下基础,同时为研究古菌病毒和宿主相互作用提供参考。首先,利用实时荧光定量技术检测了 STSV2部分病毒基因在感染后0-20 h的相对转录变化水平。结果显示,orf2的相对转录水平随时间推移出现了明显的下调,且相对表达量在感染早期最高,为早期基因;orf51的相对表达量在检测期间一直上调,在感染后16-20 h处于高表达水平,与编码STSV2衣壳蛋白的orf36具有相似的转录变化趋势,为晚期基因。为研究病毒蛋白ORF2和ORF51对宿主的影响,分别构建了ORF2和ORF51在冰岛硫化叶菌（S.islandsiucuREYl 5A）体内过表达菌株,发现ORF2和ORF51过表达均会抑制宿主细胞的生长,由此说明两种蛋白均可能参与病毒与宿主的互作过程。此外,利用CRISPR基因编辑技术对病毒基因orf2和orf51进行了敲除,得到了缺失突变株Δorf2和Δorf51。Aorf51感染宿主后,宿主细胞不能生长,导致Δorf51也不能正常增殖,说明orf51为必需基因;突变株Δorf2的表型分析还需进行后续补充。利用AlphaFold对病毒蛋白ORF2和ORF51进行结构模拟,二者均包含HTH结构域。为探究这两种蛋白与DNA的相互作用,我们选取了其相应基因及邻近基因的启动子制备DNA探针,进行了体外EMSA实验。ORF2可与P02、P03、P08和P73结合,说明ORF2具有DNA结合能力,且很可能具有普遍性的转录调控功能;ORF51虽未结合P51和P52,但通过分子筛纯化ORF51时发现了多个核酸信号峰,暗示ORF51具有核酸结合的能力。利用酵母双杂交技术验证病毒蛋白ORF2和ORF51与宿主RNA聚合酶的相互作用,结果显示ORF2和Rpo4之间、ORF51和Rpo6之间存在互作信号。之后通过体外pull-down和体内共表达实验进一步验证ORF2和Rpo4、ORF51和Rpo6之间的互作关系,结果未发现蛋白间的相互作用。推测原因有以下两点:一是两种蛋白间为直接互作,但为便于检测所添加的蛋白标签影响了蛋白间的相互作用;二是两种蛋白为间接互作,需要其他蛋白或DNA进行介导。