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目的：
乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染是全球面临的重大公共卫生问题，是引起急慢性肝炎、肝硬化及肝癌的主要病原。建立一种简便、有效、稳定的HBV感染动物模型对于探索其感染机制、寻找有效的防治方法、研制抗HBV药物都具有重要的意义。本课题组前期研究证实，新生期接种HBV的树鼩能够长期感染HBV，并且HBV能够在树鼩体内稳定复制和长期存在。本研究拟在课题组以往研究的基础上，一方面继续观察慢性感染HBV的树鼩肝组织的病理组织学改变进展、分析和比较其与人类慢性感染HBV后的病理变化过程的异同，另一方面，为寻找树鼩HBV感染率的影响因素，本课题还对慢性感染HBV的树鼩肝组织的枯否细胞数量、功能及其可能的调节因子进行检测，以探索枯否细胞在树鼩感染HBV慢性化过程中的意义，为进一步优化树鼩模型提供线索。
方法：
动物分为3组：A组，6只，为前期实验已确定慢性感染HBV（接种后1～6年）的树鼩；B组，3只，为前期实验疑似慢性感染HBV的树鼩（接种后3～4年）；C组，4只，为未接种HBV的正常对照树鼩。全部动物定期抽血和进行肝活检手术，采集的血清和肝组织标本分别作以下两部分研究。
第一部分，分析慢性感染HBV的树鼩肝组织病理学变化，主要内容有：
1．检测HBV感染指标，包括应用ELISA/TRFIA方法定性/定量检测HBV血清免疫学标志（两对半）、应用FQ-PCR定量检测血清和肝组织的HBVDNA水平、应用免疫组织化学方法检测肝组织中的HBsAg和HBcAg阳性肝细胞。
2．观察肝组织病变，包括对组织切片应用HE染色，结合网状纤维、Masson等特殊染色及透射电镜等方法，观察肝脏病理组织学及细胞超微结构的改变，评价病变级别；同时，通过Ki67、P53和Cyclin D1免疫组化染色，评价肝细胞增殖水平。
第二部分，分析慢性感染HBV的树鼩肝内枯否细胞的功能和数量变化，并分析其可能的影响因子。主要内容有：
1．检测树鼩肝组织中枯否细胞数量变化，即应用流式细胞术检测从树鼩肝活检组织分离的肝非实质细胞中CD163+细胞的比例，以及用免疫组化染色方法原位检测树鼩肝组织中的枯否细胞数量。
2．检测树鼩肝组织中枯否细胞的功能，即对手术切取的树鼩肝组织进行枯否细胞的分离、鉴定和原代培养，然后检测枯否细胞的迁移功能、吞噬功能及合成促炎症介质TNF-α的功能。其中，迁移功能的检测为以原代培养的枯否细胞开展细胞迁移实验，以及用免疫荧光染色法检测枯否细胞内的与迁移能力有关的细胞骨架成分微丝蛋白及微管蛋白的表达水平；吞噬功能的检测为应用溶酶体荧光探针检测原代培养的枯否细胞内溶酶体数量，以及用免疫组化方法原位检测肝组织中溶菌酶的表达情况；合成促炎症介质TNF-α功能的检测为应用Westem blot及实时荧光定量RT-PCR方法，分别检测肝组织TNF-α蛋白及原代培养的枯否细胞TNF-α mRNA表达水平。
3．检测树鼩肝组织中可能影响枯否细胞功能的因子，即应用实时荧光定量RT-PCR方法，检测原代培养的枯否细胞TLR-2及TLR-4等基因mRNA表达水平。
结果：
第一部分：
1．A组树鼩呈现HBV持续感染状态，6只动物于最后一次检测（接种HBV后1～6年）仍全部显示血清HBsAg和HBV DNA阳性、肝组织中有HBsAg阳性肝细胞；B组仅1只动物为血清HBsAg弱阳性，其余指标阴性；C组全部动物的HBV感染标志均为阴性。
2．A组各动物肝组织均有不同程度的慢性肝炎改变，表现为散在或弥漫分布的肝细胞水肿、脂肪变性、嗜酸性变，以及汇管区炎症——汇管区出现较明显的以淋巴细胞为主的炎细胞浸润，伴随小胆管增生；其中1只感染时间最长的动物（A1，接种HBV后6年）还出现小叶内多处坏死灶融合甚至桥接坏死及纤维化、大细胞性不典型增生等组织学改变。A组树鼩的肝活检组织学评分均值为5.33±3.93，显著高于B组(1分，P=0.018)和C组(0分，P=0.008);秩相关分析结果表明，组织学评分与动物HBV感染时长及其血清HBV DNA拷贝数呈显著的正相关关系（与感染时长的关系为r=0.808、P=0.000，与血清HBVDNA拷贝数的关系为r=0.494、P=0.014）。电镜下，A组动物的肝细胞超微结构变化表现为部分肝细胞肿大、表面微绒毛肿胀、溶酶体数量增多、胞质中糖原颗粒多少不均、线粒体肿胀变大、内质网扩张或形成不规则囊泡。免疫组化检测肝组织中的细胞增殖因子结果显示，A组动物的Ki67、P53和Cyclin D1表达水平均显著高于B组（分别为P=0.043、P=0.039和P=0.016）和C组（分别为P=0.050、P=0.021和P=0.007）；秩相关分析结果表明，肝组织的Ki67、P53及Cyclin D1的表达水平与肝组织学评分、血清HBV DNA拷贝数及肝组织HBV DNA拷贝数均有显著的正相关关系（与组织学评分的关系，分别为F0.829和P=0.000、r=0.815和P=0.001、r=0.913和P=0.000;与血清HBV DNA拷贝数的关系，分别为r=0.868和P=0.000、r=0.919和P=0.000、r=0.874和P=0.000;与肝组织HBV DNA拷贝数的关系，分别为r=0.744和P=0.004、r=0.846和P=0.000、r=0.876和P=0.000）。第二部分，树鼩肝组织分离枯否细胞的产量约为1.2±0.2x106个细胞/g肝脏，细胞活力为90%，纯度为85%。
对原代培养的枯否细胞以及对肝组织中的枯否细胞原位检测结果显示：
1．A组树鼩肝内枯否细胞数量增加——经流式细胞术测定，A、B、C三组CD163+细胞占肝非实质细胞的比例分别为89.80±0.36%、77.92±1.22%及77.97±1.13%，A组显著高于B组(P=0.034)和C组(P=0.021)；免疫组化检测结果显示，A、B、C三组肝组织内CD163阳性细胞计数分别为39.92±6.61、24.73±3.85和21.78±2.31个/高倍视野，A组显著高于B组(P=0.028)和C组(P=0.010)；秩相关分析结果显示，枯否细胞的数量与动物感染HBV时长及血清HBV DNA拷贝数存在正相关关系（与感染时长的关系为r=0.737、P=0.000，与血清HBV DNA拷贝数的关系为r=0.497、P=0.013）。
2．A组树鼩枯否细胞功能下降——经细胞迁移实验检测，A、B、C三组的迁移细胞数均数分别为6.50±0.93、16.13±0.70和16.25±0.87，A组显著低于B组(P=0.034)和C组（P=0.021）；A组枯否细胞的微丝蛋白及微管蛋白的荧光强度、细胞溶酶体荧光强度、溶菌酶免疫组化阳性表达的细胞计均低于B组和C组（微丝蛋白，P=0.034和P=0.021；微管蛋白，P=0.034和P=0.021；溶酶体荧光，P=0.034和P=0.021；溶菌酶，P=0.020和P=O.011）；A组枯否细胞TNF-α mRNA的表达水平低于B组和C组（P=0.034和P=0.021），肝组织的TNF-α蛋白质表达水平也支持上述结果。秩相关分析结果显示，溶菌酶阳性细胞计数与动物感染HBV时长及其血清HBV DNA拷贝数均存在显著的负相关关系（与感染时长的关系为r=0.890、P=0.000；与血清HBVDNA拷贝数的关系为r=-0.601、P=0.002），而TNF-α mRNA表达量与动物肝组织的HBV DNA拷贝数也呈负相关关系（r=-0.622、P=0.041）。
3．检测可能影响枯否细胞功能的因子的结果显示，A组TLR-2 mRNA及TLR-4mRNA表达水平均低于B组（P=0.034及P=0.021）和C组(P=0.034及P=0.021)。秩相关分析结果显示，TLR-2 mRNA及TLR-4 mRNA表达水平均与动物的肝组织HBV DNA拷贝数呈负相关关系（分别为r=-0.622、P=0.041和r=-0.673、P=0.023）；而该二基因的mRNA表达水平与枯否细胞的其它指标则均呈正相关关系，如与枯否细胞迁移数的关系（分别为r=0.809、P=0.003和r=0.845、P=0.001）、与溶酶体密度的关系（分别为r=0.745、P=0.008和r=0.609、P=0.047），以及与TNF-α mRNA表达水平的关系(分别为r=0.782、P=0.006和r=0.739、P=0.010)。
结论：
1．慢性感染HBV的树鼩在血清病毒学指标、组织病理学改变、超微结构特点及病程发展等方面与人类慢性感染HBV后的改变有诸多相似之处，此为其他同类动物模型所不具备的特点，是动物感染HBV研究领域的首次报道，提示树鼩感染HBV模型更适用于人类感染HBV相关的基础和临床研究。
2．慢性感染HBV的树鼩肝组织损伤、肝细胞增殖指数分别与其感染HBV病程的长短、血清HBV DNA拷贝数呈显著的正相关关系，提示HBV在宿主体内的持续感染及复制可促进肝组织慢性病变的发展；对这些慢性感染HBV的树鼩继续进行观察，将有可能证明HBV是肝癌的独立诱发因素之一。
3．慢性感染HBV的树鼩肝脏枯否细胞数量增加，但该细胞的迁移功能、吞噬功能及合成促炎症介质TNF-α等功能均下降，后者可能由该细胞表达TLR-2 mRNA和TLR-4 mRNA的水平下降所致；树鼩感染HBV的病程与其肝内枯否细胞的数量及功能变化显著相关。此系列结果提示，枯否细胞在宿主感染HBV的慢性化过程中可能起一定的调节作用。
乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染是全球面临的重大公共卫生问题，是引起急慢性肝炎、肝硬化及肝癌的主要病原。建立一种简便、有效、稳定的HBV感染动物模型对于探索其感染机制、寻找有效的防治方法、研制抗HBV药物都具有重要的意义。本课题组前期研究证实，新生期接种HBV的树鼩能够长期感染HBV，并且HBV能够在树鼩体内稳定复制和长期存在。本研究拟在课题组以往研究的基础上，一方面继续观察慢性感染HBV的树鼩肝组织的病理组织学改变进展、分析和比较其与人类慢性感染HBV后的病理变化过程的异同，另一方面，为寻找树鼩HBV感染率的影响因素，本课题还对慢性感染HBV的树鼩肝组织的枯否细胞数量、功能及其可能的调节因子进行检测，以探索枯否细胞在树鼩感染HBV慢性化过程中的意义，为进一步优化树鼩模型提供线索。
方法：
动物分为3组：A组，6只，为前期实验已确定慢性感染HBV（接种后1～6年）的树鼩；B组，3只，为前期实验疑似慢性感染HBV的树鼩（接种后3～4年）；C组，4只，为未接种HBV的正常对照树鼩。全部动物定期抽血和进行肝活检手术，采集的血清和肝组织标本分别作以下两部分研究。
第一部分，分析慢性感染HBV的树鼩肝组织病理学变化，主要内容有：
1．检测HBV感染指标，包括应用ELISA/TRFIA方法定性/定量检测HBV血清免疫学标志（两对半）、应用FQ-PCR定量检测血清和肝组织的HBVDNA水平、应用免疫组织化学方法检测肝组织中的HBsAg和HBcAg阳性肝细胞。
2．观察肝组织病变，包括对组织切片应用HE染色，结合网状纤维、Masson等特殊染色及透射电镜等方法，观察肝脏病理组织学及细胞超微结构的改变，评价病变级别；同时，通过Ki67、P53和Cyclin D1免疫组化染色，评价肝细胞增殖水平。
第二部分，分析慢性感染HBV的树鼩肝内枯否细胞的功能和数量变化，并分析其可能的影响因子。主要内容有：
1．检测树鼩肝组织中枯否细胞数量变化，即应用流式细胞术检测从树鼩肝活检组织分离的肝非实质细胞中CD163+细胞的比例，以及用免疫组化染色方法原位检测树鼩肝组织中的枯否细胞数量。
2．检测树鼩肝组织中枯否细胞的功能，即对手术切取的树鼩肝组织进行枯否细胞的分离、鉴定和原代培养，然后检测枯否细胞的迁移功能、吞噬功能及合成促炎症介质TNF-α的功能。其中，迁移功能的检测为以原代培养的枯否细胞开展细胞迁移实验，以及用免疫荧光染色法检测枯否细胞内的与迁移能力有关的细胞骨架成分微丝蛋白及微管蛋白的表达水平；吞噬功能的检测为应用溶酶体荧光探针检测原代培养的枯否细胞内溶酶体数量，以及用免疫组化方法原位检测肝组织中溶菌酶的表达情况；合成促炎症介质TNF-α功能的检测为应用Westem blot及实时荧光定量RT-PCR方法，分别检测肝组织TNF-α蛋白及原代培养的枯否细胞TNF-α mRNA表达水平。
3．检测树鼩肝组织中可能影响枯否细胞功能的因子，即应用实时荧光定量RT-PCR方法，检测原代培养的枯否细胞TLR-2及TLR-4等基因mRNA表达水平。
结果：
第一部分：
1．A组树鼩呈现HBV持续感染状态，6只动物于最后一次检测（接种HBV后1～6年）仍全部显示血清HBsAg和HBV DNA阳性、肝组织中有HBsAg阳性肝细胞；B组仅1只动物为血清HBsAg弱阳性，其余指标阴性；C组全部动物的HBV感染标志均为阴性。
2．A组各动物肝组织均有不同程度的慢性肝炎改变，表现为散在或弥漫分布的肝细胞水肿、脂肪变性、嗜酸性变，以及汇管区炎症——汇管区出现较明显的以淋巴细胞为主的炎细胞浸润，伴随小胆管增生；其中1只感染时间最长的动物（A1，接种HBV后6年）还出现小叶内多处坏死灶融合甚至桥接坏死及纤维化、大细胞性不典型增生等组织学改变。A组树鼩的肝活检组织学评分均值为5.33±3.93，显著高于B组(1分，P=0.018)和C组(0分，P=0.008);秩相关分析结果表明，组织学评分与动物HBV感染时长及其血清HBV DNA拷贝数呈显著的正相关关系（与感染时长的关系为r=0.808、P=0.000，与血清HBVDNA拷贝数的关系为r=0.494、P=0.014）。电镜下，A组动物的肝细胞超微结构变化表现为部分肝细胞肿大、表面微绒毛肿胀、溶酶体数量增多、胞质中糖原颗粒多少不均、线粒体肿胀变大、内质网扩张或形成不规则囊泡。免疫组化检测肝组织中的细胞增殖因子结果显示，A组动物的Ki67、P53和Cyclin D1表达水平均显著高于B组（分别为P=0.043、P=0.039和P=0.016）和C组（分别为P=0.050、P=0.021和P=0.007）；秩相关分析结果表明，肝组织的Ki67、P53及Cyclin D1的表达水平与肝组织学评分、血清HBV DNA拷贝数及肝组织HBV DNA拷贝数均有显著的正相关关系（与组织学评分的关系，分别为F0.829和P=0.000、r=0.815和P=0.001、r=0.913和P=0.000;与血清HBV DNA拷贝数的关系，分别为r=0.868和P=0.000、r=0.919和P=0.000、r=0.874和P=0.000;与肝组织HBV DNA拷贝数的关系，分别为r=0.744和P=0.004、r=0.846和P=0.000、r=0.876和P=0.000）。第二部分，树鼩肝组织分离枯否细胞的产量约为1.2±0.2x106个细胞/g肝脏，细胞活力为90%，纯度为85%。
对原代培养的枯否细胞以及对肝组织中的枯否细胞原位检测结果显示：
1．A组树鼩肝内枯否细胞数量增加——经流式细胞术测定，A、B、C三组CD163+细胞占肝非实质细胞的比例分别为89.80±0.36%、77.92±1.22%及77.97±1.13%，A组显著高于B组(P=0.034)和C组(P=0.021)；免疫组化检测结果显示，A、B、C三组肝组织内CD163阳性细胞计数分别为39.92±6.61、24.73±3.85和21.78±2.31个/高倍视野，A组显著高于B组(P=0.028)和C组(P=0.010)；秩相关分析结果显示，枯否细胞的数量与动物感染HBV时长及血清HBV DNA拷贝数存在正相关关系（与感染时长的关系为r=0.737、P=0.000，与血清HBV DNA拷贝数的关系为r=0.497、P=0.013）。
2．A组树鼩枯否细胞功能下降——经细胞迁移实验检测，A、B、C三组的迁移细胞数均数分别为6.50±0.93、16.13±0.70和16.25±0.87，A组显著低于B组(P=0.034)和C组（P=0.021）；A组枯否细胞的微丝蛋白及微管蛋白的荧光强度、细胞溶酶体荧光强度、溶菌酶免疫组化阳性表达的细胞计均低于B组和C组（微丝蛋白，P=0.034和P=0.021；微管蛋白，P=0.034和P=0.021；溶酶体荧光，P=0.034和P=0.021；溶菌酶，P=0.020和P=O.011）；A组枯否细胞TNF-α mRNA的表达水平低于B组和C组（P=0.034和P=0.021），肝组织的TNF-α蛋白质表达水平也支持上述结果。秩相关分析结果显示，溶菌酶阳性细胞计数与动物感染HBV时长及其血清HBV DNA拷贝数均存在显著的负相关关系（与感染时长的关系为r=0.890、P=0.000；与血清HBVDNA拷贝数的关系为r=-0.601、P=0.002），而TNF-α mRNA表达量与动物肝组织的HBV DNA拷贝数也呈负相关关系（r=-0.622、P=0.041）。
3．检测可能影响枯否细胞功能的因子的结果显示，A组TLR-2 mRNA及TLR-4mRNA表达水平均低于B组（P=0.034及P=0.021）和C组(P=0.034及P=0.021)。秩相关分析结果显示，TLR-2 mRNA及TLR-4 mRNA表达水平均与动物的肝组织HBV DNA拷贝数呈负相关关系（分别为r=-0.622、P=0.041和r=-0.673、P=0.023）；而该二基因的mRNA表达水平与枯否细胞的其它指标则均呈正相关关系，如与枯否细胞迁移数的关系（分别为r=0.809、P=0.003和r=0.845、P=0.001）、与溶酶体密度的关系（分别为r=0.745、P=0.008和r=0.609、P=0.047），以及与TNF-α mRNA表达水平的关系(分别为r=0.782、P=0.006和r=0.739、P=0.010)。
结论：
1．慢性感染HBV的树鼩在血清病毒学指标、组织病理学改变、超微结构特点及病程发展等方面与人类慢性感染HBV后的改变有诸多相似之处，此为其他同类动物模型所不具备的特点，是动物感染HBV研究领域的首次报道，提示树鼩感染HBV模型更适用于人类感染HBV相关的基础和临床研究。
2．慢性感染HBV的树鼩肝组织损伤、肝细胞增殖指数分别与其感染HBV病程的长短、血清HBV DNA拷贝数呈显著的正相关关系，提示HBV在宿主体内的持续感染及复制可促进肝组织慢性病变的发展；对这些慢性感染HBV的树鼩继续进行观察，将有可能证明HBV是肝癌的独立诱发因素之一。
3．慢性感染HBV的树鼩肝脏枯否细胞数量增加，但该细胞的迁移功能、吞噬功能及合成促炎症介质TNF-α等功能均下降，后者可能由该细胞表达TLR-2 mRNA和TLR-4 mRNA的水平下降所致；树鼩感染HBV的病程与其肝内枯否细胞的数量及功能变化显著相关。此系列结果提示，枯否细胞在宿主感染HBV的慢性化过程中可能起一定的调节作用。