microRNA是一类长度在22nt左右的非编码调控RNA,它们通过与靶基因mRNA的3’UTRs不同程度的互补结合,以降解mRNA和抑制翻译两种方式调节生物体内的基因表达,发挥转录后抑制的功能。生物信息学预测哺乳动物的microRNA能够调节高达30%的编码蛋白的基因,越来越多的证据表明microRNA在多种病理、生理条件下发挥着重要的调节功能。在众多microRNA中,miR-146a最早被证实为参与天然免疫的调控因子,在免疫反应和炎症性疾病中发挥重要作用。当LPS刺激和病毒感染时,miR-146a在多种细胞中发挥负反馈调节因子作用,在单核细胞、肺泡上皮细胞、神经小胶质细胞中通过作用其靶基因IRAK1/2和TRAF6,抑制Toll样受体信号通路活性,发挥炎症抑制因子的作用。在骨髓过继传输重建免疫系统的小鼠体系中,miR-146a被报道通过下调靶基因FADD的表达,抑制T细胞凋亡和IL-2表达,参与白血病发病。而在miR-146a基因敲出小鼠中,由于miR-146a的缺失导致调节性T细胞部分抑制功能异常,使其丧失对于STAT信号通路的抑制作用,IFN-Y表达升高,引起T细胞活化,发生自身免疫性疾病,结果揭示了miR-146a在Treg细胞发挥外周免疫耐受中的重要调节作用。以上研究都证明miR-146a在慢性炎症和获得性免疫的过程中,仿佛一个强大的“刹车片”,发挥着负反馈抑制的功能。microRNA表达谱研究表明,当生理或病理的免疫反应过程中,miR-146a的表达水平有显著变化。对比天然B细胞或天然T细胞,miR-146a在终末分化的淋巴细胞亚群Tfh、Treg和GC B细胞之中显著升高。另外我们在之前的临床研究工作中发现,类风湿性关节炎滑膜组织中的CD4+T细胞的miR-146a表达显著高于健康对照,并且高表达的miR-146a水平与TNF-a的水平呈正相关。据文献报道,在癌症、Sjogren综合征和硬皮病等自身免疫性疾病中,miR-146a同样呈现高表达。这些疾病之中miR-146a都处于高标达状态,而miR-146a在天然免疫之中发挥负反馈的机制显然无法准确解释疾病慢性化和病理反应持续存在的这一现象。为了在体研究miR-146a在慢性炎症、自身免疫性疾病中发挥的准确作用,我们构建了高表达miR-146a的转基因小鼠。我们采用注射高浓度慢病毒构建了miR-146a转基因小鼠,通过PCR扩增转基因小鼠基因组特有病毒载体片段,鉴定构建成功的转基因小鼠FO代的4个小鼠。并且利用转基因小鼠中eGFP与miR-146a同时表达的这一特性,通过流式细胞仪快速鉴定小鼠外周血中eGFP的表达,从而快速的筛选、鉴定转基因小鼠。利用此方法,我们可以快速鉴定转基因阳性小鼠,并回交9代以上建立了稳定品系。应用荧光定量PCR技术,我们分析了转基因小鼠的心、肝、脾、肺、肾、淋巴结等组织的miR-146a表达。定量PCR结果显示,转基因小鼠的miR-146a的表达水平高于野生型对照3-8倍,而这样的表述水平与自身免疫性疾病中miR-146a表达水平近似,同时我们也排除了miR-146a*对转基因小鼠功能及表型影响的可能性。miR-146a转基因小鼠成功构建后,我们分析了其病理及免疫相关的表型。3周龄起,miR-146a转基因小鼠出现脾脏和淋巴结肿大,在第4周差异最大达到8倍,而6周龄后保持在4倍左右。病理组织学的分析显示早在8周龄,转基因小鼠出现肺和肝脏的炎症浸润。先前有报道提示miR-146a可能参与血小板的形成,所以我们对转基因小鼠进行全血血象分析,但是除了单个核细胞数量略高外,其它所有分析项目均与野生型小鼠没有显著区别。接下来我们进行了淋巴细胞各个亚群的分析。在T淋巴细胞亚群中,首先发现Treg细胞频率略下降,但是T细胞(CD4+T和CD8+T)表面活化标志分析中(包括CD25, CD69, CD44和CD62L),并未发现T细胞活化。而其它T细胞亚群的表达频率与野生型对照无显著差异,胸腺内T细胞发育也正常。说明Treg细胞的频率降低,还不足以诱导T细胞活化。另外一个T淋巴细胞的重要发现是,转基因小鼠脾脏中发现显著升高的双阴性T细胞(CD3+CD4-CD8" TCRαβ+, double negative T, DNT),并且这一现象在8-52周龄小鼠中均有发现。miR-146a转基因小鼠中发现：DN T细胞增加,淋巴结、脾脏肿大,肝、肺炎性浸润,而且这些病理表象皆在低龄小鼠中发现,这一系列的病理表象与人类自身免疫性淋巴增生综合征(autoimmune lymphoproliferative symdrome, ALPS)十分相像。按照ALPS的临床表现之一IL-10等细胞因子、血清免疫球蛋白也会相应增高。所以我们使用MILLIPLEX方法测定转基因小鼠血清中32种细胞因子和趋化因子表达。结果显示8周龄转基因小鼠中血清中免疫球蛋白IgG1, IgG2a, IgG2b和IgG3显著高于同年龄野生型小鼠,但是当小鼠年龄到达52周龄时,虽然IgG1和IgG2a仍高于野生型对照,但IgG2b, IgG3已经恢复。而血清中32种细胞因子和趋化因子,血清IgM和IgA在转基因和野生型8-52周龄小鼠之间并无显著差异。与血清IgG升高水平一致,B淋巴细胞(B220+)数量显著增高,但表达频率并无显著变化,同时我们检测B淋巴细胞其它亚群也无显著区别,包括成熟B细胞(B220+AA4.1-)、未成熟的B细胞(B220+AA4.1+)、新形成的或活化的B细胞(B220+IgM+CD21lowCD23low)、滤泡B细胞(B220+IgM+CD21intCD23high),骨髓中B细胞发育也正常。然而,当我们将增大的淋巴结进行常规病理发现在淋巴结中有许多疑似生发中心的结构,进一步的免疫组织化(PNA染色)证实最早在8周龄转基因小鼠中检测到大量自发生发中心结构,同时免疫荧光共聚焦分析也得到了一致的结果。这一现象提示我们马上检测与之生发中心形成相关的Tfh和GC B细胞,结果发现转基因和野生型小鼠之间Tfh细胞比例没有显着的差异；而在8-52周龄的转基因小鼠中的淋巴结、肠系膜淋巴结、PP体、脾脏等外周淋巴器官中,都发现GC B细胞的比例显著升高。综上所述,在miR-146a转基因小鼠中发现脾脏和淋巴结肿大,肝脏、肺部炎症浸润,DN T细胞累积,血清IgG升高,GC B细胞增多,并且这些病理表型发病较早,随年龄增长有一定的缓解。综上所述转基因小鼠的这些病理表征与人类自免性淋巴增生综合征的临床表现一致,说明我们构建的miR-146a转基因小鼠自发形成ALPS。自免性淋巴增生综合征的主要致病因素就是Fas基因突变和蛋白表达不足,Fas介导的凋亡通路异常。为此,我们分析了野生小鼠及miR-146a转基因小鼠多个淋巴细胞亚群中Fas的表达。在生理条件下,野生型小鼠体内Fas只在GC B细胞之中高表达,而上调miR-146a只在GC B细胞内显著下调了Fas的蛋白表达,对其它细胞亚群中的Fas表达并无影响。生物信息学分析显示,在人、大鼠和小鼠3个种属内,miR-146a的种子区与Fas的3’UTR大体互补,提示Fas是miR-146a的潜在靶基因。我们使用荧光素酶报告基因法分析miR-146a的靶基因,共转染编码miR-146a和Fas的3’UTR区域的质粒于293FT细胞中,分析结果证实Fas是miR-146a的直接靶基因。为了进一步证明了miR-146a靶向Fas基因下调其表达是特异性发生在生发中心形成过程中,而不是源于B细胞发育过程中的影响。我们分离miR-146转基因或野生型小鼠的non-GC B细胞,分别混合野生型型CD4+T细胞,然后过继转移到SCID小鼠,7天后检测来源于供体小鼠non-GC B细胞所形成GC B细胞的百分比及新生成GC B细胞之中Fas的表达。结果显示来源于转基因小鼠的新形成的GC B细胞比例(27-42%)显著高于来源于野生型的的GC B细胞比例(4-16%)。而相应的来源于转基因小鼠的GC B细胞中Fas表达显著低于野生型来源。以上结果说明,Fas是miR-146a在GC B细胞中的靶基因,而且其抑制作用特异性发生在生发中心形成过程中。为了进一步阐明miR-146a的介导B细胞功能障碍的机制,我们分离野生型和转基因小鼠的天然B细胞,应用cDNA表达谱芯片研究miR-146a在B细胞中的靶基因,将基因芯片得到的原始数据进行Sylamer分析,进而分析相关信号通路。将miR-146a的种子区的两个结构域与mRNA表达下调基因的3’端非编码区进行富集比对,发现这些能与niR-146a种子区互补配对的基因主要集中在转基因B细胞中。将得到的差异基因进行信号通路分析,发现主要集中在NF-κB, AP-1, IRF和STAT几个信号通路中,先前已经被确认的TRAF6, IRAK1和CXCR4在我们的实验中再次得到验证。而这些结果与我们体外B细胞增殖实验一致,即在LPS刺激下,miR-146a高表达抑制了B细胞增殖。说明miR-146a通过抑制NF-κB信号通路,发挥负反馈调节作用同样适用于B细胞。转基因小鼠体内大量增殖的天然B细胞可以用淋巴细胞稳态增殖的机制来解释。为了验证这一假设,我们分离转基因和野生型小鼠的天然B细胞或CD4+T细胞,将其过继传输到免疫缺陷的SCID受体小鼠体内,用EdU掺入法检测淋巴细胞的稳态增殖情况。在过继传输的7天后,我们发现来源于转基因小鼠的天然B细胞增殖情况显著高于来源于野生小鼠的B天然细胞,但是CD4+T细胞二者之间没有显著差异,同时我们还发现高表达miR-146a的B细胞可以促进T细胞的稳态增殖。结果揭示B细胞中持续表达的miR-146a促进B细胞和T细胞的稳态增殖,这些发现为ALPS发病机制提供了一种新解释。大多数的ALPS患者表现为在幼年即出现非恶性淋巴结肿大及脾肿大,显著增加双阴性性T细胞,和较高的血清IgG水平。所有病理表型在年幼时病情严重,而随着年龄增长病情在一定程度上得以缓解。miR-146a转基因小鼠三周龄即出现脾脏和淋巴结肿大,生后的第四周达到顶峰。所有年轻的转基因小鼠的脾脏中都观察到双阴性T细胞增高。8周龄转基因小鼠血清IgG1, IgG2b, IgG2a和IgG3的浓度高出野生型对照3-6倍,而52周龄时已经有部分缓解。临床上4-5%的ALPS患者存在肺部浸润性病变和肝功能障碍,而miR-146转基因小鼠肺和肝脏炎症细胞浸润发病率极高。另外,ALPS患者易患霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤,而我们的转基因小鼠老年肿瘤发病率达到20%以上(结果未出示)。不过,miR-146转基因小鼠与ALPS患者诊断标准之间也有很大区别,25%的ALPS患者体内可检测到自身抗体,miR-146转基因小鼠血清检测不到自身抗体。此外,IL-10显着增加也是ALPS患者的典型临床表现,而我们分析了血清中32种细胞因子和趋化因子都没有显著的改变。这些数据说明,单独改变一个microRNA(miR-146a)的表达,并没有打破小鼠体内的免疫耐受状态,而主要是促进了淋巴细胞稳态增殖,而ALPS的发病还需要诸如Fas等基因突变的累积,典型ALPS患者遗传缺陷主要发生在凋亡通路,会直接打破淋巴细胞稳态和免疫耐受。有报道显示Fas基因突变和蛋白表达不足是ALPS发病的主要原因。本研究中,我们证实了高表达miR-146a下调了GC B细胞内的Fas表达,最终导致转基因小鼠形成ALPS病理表症。在我们转基因小鼠研究模型中,ALPS的致病因子似乎是高表达的miR-146a的天然B细胞。而且天然B细胞的稳态增殖可以促进T细胞的增殖,天然B细胞表面Fas表达下降,使得其更易于转化为GC B细胞。这些发现结合先前的研究揭示,在GC B细胞内特异地下调Fas表达,会使淋巴细胞稳态失衡而导致淋巴细胞过度增生。我们推测GC B细胞内下调Fas表达,还可促进成熟T细胞的存活,使得活化T细胞易于丢失CD4或CD8的共受体,因此导致DN T细胞累积。有研究表明慢性活化性EB病毒感染患者呈现出ALPS患者的临床表现,而EB病毒则可以显著升高miR-146a的表达,这两个发现支持miR-146a参与ALPS发病机制,同时也为非Fas突变类ALPS发表机制提供了一个新解释,尤其是伴随病毒感染和慢性炎症的病例。我们提出一个假说,miR-146a缺陷小鼠发生自身免疫性疾病,反映了miR-146a的抑制NF-B信号通路的功能；而miR-146a转基因小鼠出现ALPS表征,则反映了miR-146a促进淋巴细胞稳态增殖的特性。