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疫霉属真菌是水果及其种苗上一类非常重要的病害,其中丁香疫霉phytophthora syringae、冬生疫霉P. hibernalis、栗疫霉黑水病菌P. cambivora、草莓疫霉红心病菌P. fragariae、树莓疫霉根腐病菌P. fragariae var. rubi为我国禁止进境5种检疫性疫霉。疫霉菌侵染寄主植物引起根腐、茎腐、果腐、溃疡等症状,导致植物大量减产,甚至绝产、死亡,具有流行性和毁灭性。目前疫霉菌的常规检疫方法主要依据病原菌的形态特征、生物学特性等差异,而传统的形态学鉴定方法周期长,且步骤繁,已不能满足口岸快速检测的要求。因此,必须加大对进境水果及其种苗检疫性疫霉的口岸检疫力度,建立快速、准确、灵敏的检测方法,以保护我国水果产业的安全。目前国内外水果检疫性疫霉检测主要基于常规PCR、实时荧光PCR,鲜有关于多重PCR和多重实时荧光PCR的报道。本研究基于柑橘属、苹果属、李属及莓类4类水果及其种苗,以5种检疫性疫霉以及其近似种为研究对象,展开了疫霉菌的分子生物学等方面的详细研究。比较分析5种检疫性疫霉的18S rRNA、ITS、 Heat Shock Protein 90 (HSP 90)、Ras-like Protein (Ypt1)、nad 9及Enolase等多个基因,根据序列位点差异,分别设计了疫霉菌通用引物,5种检疫性疫霉的特异性引物,冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉的Taqman探针,建立了各类水果及其种苗上检疫性疫霉的多重PCR、多重实时荧光PCR检测方法。本研究取得了如下研究成果：1、建立了柑橘属、苹果属、李属和莓类水果及其种苗上检疫性疫霉的多重PCR检测方法通过疫霉属多个基因序列比对,利用Primer Premier5引物软件,针对疫霉属真菌18S rRNA基因设计了通用引物,根据5种检疫性疫霉的ITS、heat shock protein90、Ypt 1和nad 9基因分别设计了冬生疫霉、丁香疫霉、栗黑水疫霉、草莓疫霉红心病菌和树莓疫霉根腐病菌的特异性引物,优化反应体系,建立了四类水果及其种苗检疫性疫霉的多重PCR检测方法。利用建立的方法进行模拟检测试验,能够有效扩增目的片段,阴性对照没有扩增出条带。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳及EB染色,可直接读出检测结果。2、建立了柑橘属、苹果属和李属水果及其种苗上检疫性疫霉多重实时荧光PCR检测方法通过疫霉属多个基因序列比对,利用Prime Primer 3探针设计软件,针对冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉的Enolase、HSP90和Yptl基因分别设计了3中疫霉菌的特异性探针和引物对,经过体系优化,建立了柑橘属、苹果属和李属水果及其种苗上检疫性疫霉的多重实时荧光PCR检测方法。建立的多重实时荧光PCR检测方法能同时检测出各类水果的检疫性疫霉。3、建立了冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉的环介导等温扩增(LAMP)检测方法针对冬生疫霉Enolase、丁香疫霉的ITS和栗黑水疫霉Yptl基因序列,运用引物设计软件(https://primerexplorer. Jp/e/)在线进行LAMP引物设计。经过体系优化,LAMP反应阳性样品在2%琼脂糖凝胶中电泳观察均出现各自的特征性梯状条带,通过肉眼观察到阳性反应呈白色浑浊,加入SYBR Green I荧光染料观察颜色均出现颜色变化。建立的冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉的LAMP检测方法可直接检出反应结果。本研究建立的多重PCR、多重实时荧光PCR和LAMP检测方法可实现对带菌水果的直接检测。全部检测可在1d内完成。有效促进水果的快速通关,为口岸检测和病原菌的田间监测提供了可靠的方法。