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唐鱼(Tanichthys albonubes)又名白云金丝鱼，属鲤形目，鲤科，鱼丹亚科，唐鱼属，为我国特有种。由于唐鱼具有和斑马鱼等模式生物相似的特征，如个体小、性成熟期与孵化期短、多次产卵、胚体透明等，适合于作为转基因研究的受体鱼。近年来在转基因鱼研究中提出了转自源基因的概念，有多位学者开始了自源基因的转化研究并取得进展。本实验克隆了唐鱼生长激素基因，利用本实验室已分离到的具有强启动活性的β-actin基因启动子，构建了自源生长激素基因表达载体，采用显微注射方法，获得生长快、个体大的的转基因唐鱼。主要研究内容如下：
1.采用RT-PCR和RACE技术分离唐鱼生长激素基因(GH)全长cDNA序列，同时利用PCR克隆了唐鱼生长激素基因的基因组(gDNA)序列。序列分析表明：唐鱼GH cDNA的5’非编码区为64 bp，3编码区448bp，开放阅读框(ORF)633bp，共编码210个氨基酸，包括22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟肽。应用MEGA 3.1软件进行序列同源性比较分析的结果显示，唐鱼GH cDNA所编码的氨基酸序列与近缘鱼种(草鱼、青鱼、鳙鱼、鲤鱼、斑马鱼等)的生长激素氨基酸序列有很高的同源性，其中与草鱼和鳙鱼的同源性高达98％。该研究获得的唐鱼生长激素基因的gDNA序列共有1403 bp，包括4个外显子和3个内含子，外显子大小分别150 bp、117 bp、162 bp、204 bp。三个内含子都以GT开头，AG结尾，符合GT-AG法则。根据GH编码氨基酸序列对分属14个科的25个物种，包括人和其它哺乳动物(牛、鼠、猪)及鸟类等进行分子进化树聚类分析，结果与根据传统的形态学和生化特征分类的进化地位基本一致。
2.RT-PCR和高保真PCR分别克隆唐鱼β-actin基因cDNA和gDNA序列。gDNA测序结果表明：唐鱼β-actin基因由五个外显子和四个内含子组成，外显子长度分别为123bp、240bp、439bp、182bp、144bp。β-actin基因cDNA全长1787bp，编码了375个氨基酸，与其他物种actin家族相比具有高度保守性。唐鱼β-actin编码的氨基酸与青鱼、鲤鱼、草鱼及斑马鱼同源性均为99.7％，与鲮鱼的同源性为99.5％，与罗非鱼、斜带石斑鱼、人及家鼠的同源性均为98.9％。
3.构建了转自源生长激素基因表达载体pTLA-GH。pTLA-DsRed是本实验室前期完成构建的一个红色荧光蛋白基因表达载体，是将唐鱼β-actin基因的启动子定向插入到不含启动子的红色荧光表达载体pDsRed2-1而构建的表达载体，并已证实该启动子具有强驱动活性。将本实验所克隆的唐鱼生长激素基因的开放阅读框(ORF)替换pTLA-DsRed中的DsRed基因从而构建含唐鱼β-actin基因的启动子和唐鱼生长激素基因ORF(含有编码信号肽的核苷酸序列)的表达载体pTLA-GH。
4.转自源生长激素基因唐鱼的获得与检测。表达载体pTLA-GH，经线性化后采用显微注射的方法转入唐鱼的受精卵中。实验共注射了204粒受精卵，其中有85粒卵孵化出膜，培育成活的转生长激素基因唐鱼共有37尾。实验鱼养殖100d，实验组最大个体体重1.120g，是对照组最大个体体重的2.1倍，是对照组平均体重的3.0倍。提取部分转基因唐鱼的内脏、眼睛、鳍条和肌肉进行PCR检测，在超大型的唐鱼中均可检测到转植基因。实验还采用了共注射方法，将生长激素表达载体pTLA-GH和红色荧光蛋白表达载体p17LA-DsRcd共注射到唐鱼的受精卵中。培育86 d，实验组最大个体体重是对照组最大个体的1.7倍，是对照组平均体重的2.5倍。实验组大型个体中均可见红色荧光蛋白表达且PCR均可检测到pTLA-GH和pTLA-DsRcd基因，说明共注射可提高转植基因的检测效率。
5.采用高保真PCR技术从尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)基因组中分离到具有转录活性的β-肌动蛋白(β-actin)基因启动调控序列。序列分析显示该片段包括长为1 643 bp的β-actin基因5’端侧翼区的启动调控区和90 bp的部分转录区序列。将尼罗罗非鱼β-actin基因的启动调控区定向克隆到不含启动子的红色荧光表达载体pDsRed2-1中，构建了红色荧光表达载体。该载体经EcoR I线性化后，显微注射到唐鱼(Tanichthys albonubes)的受精卵中，利用荧光显微镜观察红色荧光蛋白基因(DsRed2)在唐鱼中的表达。结果表明，在荧光显微镜下以及普通解剖镜下均可观察到红色荧光，说明本实验分离到的罗非鱼β-actin基因启动子序列具有有效的驱动功能。这为下一步转自源生长激素基因罗非鱼的获得奠定了基础。小结本研究首次克隆了唐鱼生长激素基因和β-actin基因，构建了自源生长激素基因表达载体，应用显微注射方法成功获得了生长快、个体大的转自源生长激素基因唐鱼。表达载体与红色荧光蛋白载体共注射结果可提高转植基因的检测效率。本研究还分离了尼罗罗非鱼的β-actin基因启动子并证实其具有转录活性。本研究结果为下一步通过自源基因转植培育生长快、个体大的经济鱼类新品系奠定了基础。