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低温敏感型叶色突变体是研究低温条件下叶绿体发育和叶绿素生物合成机制的理想材料。本课题组利用小麦紫条纹叶色突变体PSL1后代群体中的一紫条纹叶色单株,对其连续6代自交并定向单株选择,育成一对低温敏感/不敏感叶色近等基因系,即:对低温敏感的紫叶色系pur1和对低温不敏感的正常绿叶色系gre1。为揭示低温敏感型紫叶突变系pur1叶色变异的分子机制,本研究以近等基因系pur1和gre1为试验材料,对其进行RNA-seq测序分析,并结合叶色和农艺性状调查、叶绿素和花青素含量测定、类胡萝卜素高效液相色谱分析和叶绿体超微结构分析,以揭示低温条件下pur1叶色变化过程中的基因表达变化和生理生化变化,挖掘低温条件下叶色突变的关键候选基因,为pur1叶色形成机理的深入研究提供理论依据。主要研究结果如下:1.在正常秋季播种(2017年10月1日)之后,对低温敏感型紫叶色系pur1和低温不敏感的正常绿叶色系gre1的田间叶色表型进行追踪调查。与正常叶色gre1系相比,pur1幼苗的新生叶在初秋季节为正常绿色(2017年10月10日-2017年12月8日);随着秋冬季的进展,新生叶片叶色逐渐呈黄绿色(2017年12月9日-2018年1月23日);到深冬季节受环境温度降低的影响,新生叶色呈现紫红色(2018年1月24日-2018年2月15日);到冬末至初春阶段,新生叶片白化(2018年2月16日-2018年3月16日);至春季随着气温的升高,植株新生叶的叶色又逐渐转至正常绿色(2018年3月17日-2018年4月10日)。仅新生叶组织随温度升高叶色恢复为绿色,pur1株原有叶片中已经白化的组织不会复绿。相比之下,gre1植株的新生叶片在整个幼苗期和成株期均保持正常绿色(2017年10月10日-2018年4月10日)。对pur1和gre1主要农艺性状调查发现,pur1的单株成穗数和穗粒数显著低于gre1植株(P<0.05),发育进程缓慢,抽穗期和成熟期比gre1推迟6d左右,但是二者在株高、旗叶长/宽、穗长和千粒重等方面没有显著差异。2.利用核基因组SSR标记(ncSSR)和叶绿体基因组SSR标记(cpSSR)分别对低温敏感型紫叶色系pur1和低温不敏感的正常绿叶色系gre1的遗传背景进行了分析。结果显示,均匀分布于小麦21条染色体上的42对ncSSR标记中,有37对标记在pur1和gre1间扩增均为单态,仅5对标记检测到差异条带。由此可见,在核基因组水平,pur1和gre1间的遗传相似度为88.1%(37/42)。32对小麦叶绿体基因组SSR标记(cpSSR)检测分析结果表明,所有标记在pur1系和gre1间均扩增为单态。以上结果表明,低温敏感型紫色系pur1和低温不敏感正常绿色系gre1的遗传背景相似度很高,二者为一对对低温敏感/不敏感叶色近等基因系,是研究低温条件下小麦叶绿体形成、发育和叶绿素合成机制的理想遗传材料。3.对近等基因系pur1和gre1进行高通量测序分析,共构建了6个cDNA文库,每个样品获得7Gb左右的序列数据。在pur1和gre1之间共鉴定了7135个差异表达基因(DEGs),在pur1样品中有5857个基因显著上调表达,1278个基因显著下调表达。基于GO和KEGG数据库对差异基因进行生物学功能注释,结果显示,DEGs主要参与碳固定、光合作用、光合作用天线蛋白、Ribosome、卟啉-叶绿素代谢、类胡萝卜素合成和类黄酮/花青素合成等代谢通路。此外,调控叶绿体发育的Golden2-Like(GLK)转录因子家族和DnaJ基因家族在pur1中显著下调表达。利用qRT-PCR技术对15个关键候选基因的表达水平进行了验证,发现实时荧光定量结果与转录组数据一致,表明转录组结果可靠性较高。4.通过对冬季低温条件下新生幼嫩叶片的色素含量比较分析,结果发现,与gre1系相比,pur1系中叶绿素(Chl)和类胡萝卜素(Caro)的含量均显著降低(P<0.05),分别为gre1的25.9%和26.9%。花青素含量测定结果表明,pur1中花青素的含量显著高于gre1(P<0.01),pur1中花青素积累量约为gre1的20倍。5.利用高效液相色谱(HPLC)进一步比较分析低温条件下新生叶片的类胡萝卜素组分,结果表明,pur1植株中玉米黄质的含量与gre1无显著差异,叶黄素和?-胡萝卜素的含量极显著降低(P<0.01),?-隐黄质和?-胡萝卜素的含量显著降低(P<0.05)。此外,还鉴定到了紫黄质和新黄质,其含量在pur1中显著低于gre1。6.叶绿体超微结构的透射电镜观察结果表明:pur1植株叶绿体的结构受环境温度的影响在不同的叶色期呈现一系列动态变化。在低温条件下,pur1的叶绿体离壁生长趋向细胞中央,形状不规则,内部结构排列紊乱,内膜系统破坏,基质和基粒类囊体降解。gre1植株的叶绿体在整个生育周期内均呈现发育良好的类囊体膜和紧密堆叠的基粒和基质片层。