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缺血心肌恢复血流灌注过程中产生的心肌损伤,称为心肌缺血一再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI),常见于冠心病等心血管疾病及外科心血管疾病治疗过程。心肌缺血-再灌注损伤的发生涉及活性氧产生、钙超载及能量代谢障碍等机制,其结果是导致心肌细胞的死亡。由过氧化氢、超氧阴离子、羟自由基等活性氧导致的氧化应激在心肌缺血-再灌注损伤的发生过程中起着重要作用。 近年来,不少学者重视细胞内源性保护机制在疾病防治中的作用,关注焦点之一是热休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)。HSPs是细胞在生理状态下必需而在应激状态(特别是热应激)时表达增多的一类保护性蛋白质。HSPs的主要功能是分子伴娘(molecular chaperone)功能,即参与蛋白质的正确折叠、解聚、复性和协助转运等。热休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)是HSPs家族中最为重要的成员。热休克蛋白70可分为组成型Hse70和诱导型Hsp72两种,它们在结构和功能方面类似。作为一个细胞中预先存在的分子伴侣,Hsc70具有显著的抗心肌缺血及其他损伤作用。尽管已经取得了上述进展,但心肌损伤时,Hsc70究竟与哪些分子相互作用从而发挥其心肌保护功能,目前仍不十分清楚。 为了筛选Hsc70相互作用的蛋白质,本研究采用ADP亲和层析分离纯化正常大鼠心肌和缺血.再灌注损伤心肌中的Hsc70相互作用蛋白,应用二维凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)技术进一步分离上述Hsc70相互作用蛋白质,采用图像分析识别正常心肌组织和缺血-再灌注损伤心肌组织中Hsc70相互作用差异蛋白质点,采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定差异蛋白质,然后采用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation)和体外蛋白质重叠实验(protein overlay assays)对相互作用关系进行验证。为了探讨Hsc70抗心肌细胞损伤的具体机制,采用基因转染和RNA干扰技术检测了Hsc70过表达和表达抑制对过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)所致的相互作用蛋白GAPDH、ENOA和ALDH2的表达和活性的影响;以及Hsc70过表达和表达抑制对过氧化氢所致的心肌细胞损伤的影响。主要的实验结果如下: 1、大鼠缺血-再灌注损伤心肌中Hsc70相互作用蛋白的初步筛选 (1)大鼠心肌缺血-再灌注损伤模型的构建:结扎大鼠心脏冠状动脉左前降支30分钟后再灌注60分钟,血清中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、肌酸激酶(creatine kinase,CK)明显增多。TTC染色显示,与假手术组相比,缺血.再灌注损伤组心肌梗死面积明显增加,提示心肌缺血.再灌注损伤模型构建成功。 (2)大鼠缺血-再灌注损伤心肌中Hsc70相互作用蛋白2-DE图谱的建立与分析:采用ADP亲和层析技术从正常心肌组织和缺血-再灌注损伤心肌中分离纯化Hsc70及其相互作用蛋白,应用2-DE技术建立了正常心肌和缺血.再灌注损伤心肌的Hsc70相互作用蛋白2-DE图谱,图像分析识别了56个差异的蛋白质点,采用MALDI-TOF-MS鉴定了32个蛋白质。结果发现32个蛋白质中有21个为代谢相关蛋白,其功能主要涉及能量代谢、氧化磷酸化及电子传递等方面,说明Hsc70可能通过与这些蛋白质的相互作用,在改善能量代谢、清除自由基等方面发挥心肌内源性保护作用。 2、大鼠缺血-再灌注损伤心肌中Hsc70相互作用蛋白的验证 抽提正常和缺血.再灌注损伤大鼠心肌以及正常和暴露于H2O2的大鼠心肌细胞裂解液,应用Hsc70抗体进行免疫沉淀后,对沉淀物中的蛋白应用不同抗体进行Western blot分析。结果表明,在正常大鼠心肌和H9c2心肌细胞中,Hsc70与ENOA、GAPDH和ALDH2结合,氧化应激损伤时,Hsc70也可与ENOA、GAPDH和ALDH2结合,但是结合并没有明显差别。通过体外蛋白质重叠实验,我们还发现Hsc70可与ENOA、GAPDH直接结合。 3、从分子伴侣角度研究Hsc70保护过氧化氢所致心肌细胞损伤的机制 (1)Hsc70对H2O2所致的ENOA、GAPDH和ALDH2表达的影响: 以真核表达质粒pcDNA3.1(-)为载体构建Hsc70的全长真核表达载体pcDNA3.1(-)-Hsc70,将Hsc70全长表达载体瞬时转染H9c2心肌细胞,采用Western blot分析证明细胞中的Hsc70表达明显增加。将Hsc70RNA干扰质粒瞬时转染心肌H9c2细胞,Western blot分析发现Hsc70在心肌细胞中表达明显下调。 正常情况下,ENOA的表达在Hsc70过表达和Hsc70RNA干扰细胞中没有明显变化。H2O2处理后,心肌细胞中ENOA表达上调,Hsc70过表达和Hsc70RNA干扰对H2O2所致的ENOA表达没有明显影响。 正常情况下,GAPDH和ALDH2的表达在Hsc70过表达和Hsc70低表达心肌细胞中没有明显改变。H2O2处理后,Hsc70过表达和Hsc70RNA干扰对GAPDH和ALDH2的表达也没有影响。 以上结果说明在H2O2所致的大鼠心肌细胞氧化应激损伤中,Hsc70过表达和表达抑制均不影响ENOA、GAPDH和ALDH2的表达。 (2)Hsc70对H2O2所致的ENOA、GAPDH和ALDH2活性的影响: 收集正常和H2O2处理后的心肌细胞,检测细胞中ENOA、GAPDH的活性,发现正常情况下Hsc70过表达和低表达对大鼠心肌细胞中ENOA和GAPDH活性没有明显影响。经H2O2处理后,大鼠心肌细胞中ENOA和GAPDH活性降低,但Hsc70过表达抑制了H2O2所致的ENOA和GAPDH活性下降,而Hsc70低表达促进了H2O2所致的ENOA和GAPDH活性下降。 采用50μmol/L的ALDH2的特异性抑制剂daidzin预处理心肌细胞后,收集正常和H2O2处理后的心肌细胞,检测细胞中ALDH2的活性。结果发现:正常情况下,Hsc70过表达或低表达对大鼠心肌细胞的ALDH2活性没有明显影响。Daidzin预处理后,细胞中ALDH2活性降低了50％。经H2O2处理后,大鼠心肌细胞中ALDH2活性降低,而daidzin预处理再经H2O2处理后ALDH2活性下降更为明显。Hsc70过表达明显抑制了H2O2所致的ALDH2活性降低,Hsc70低表达促进了H2O2所致的ALDH2活性下降。 (3)Hsc70对H2O2所致大鼠心肌细胞损伤的影响: Hsc70过表达对H2O2所致大鼠心肌细胞损伤的影响:应用Hsc70真核表达载体转染大鼠心肌细胞,发现Hsc70过表达明显抑制了H2O2所致的心肌细胞存活率降低、培基中LDH释放和细胞凋亡发生。 Hsc70低表达对H2O2所致大鼠心肌细胞损伤的影响:应用RNA干扰技术抑制Hsc70的表达,发现Hsc70低表达进一步加剧了H2O2所致的心肌细胞存活率降低、培基中LDH释放和细胞凋亡发生。 Hsc70过表达和低表达对daidzin预处理后H2O2所致大鼠心肌细胞损伤的影响:daidzin预处理后再经H2O2处理比单独H2O2处理引起的心肌细胞坏死和细胞凋亡更为明显,Hsc70过表达能够减轻daidzin预处理后H2O2所致心肌细胞损伤,而Hsc70表达抑制加剧了daidzin预处理后H2O2所致心肌细胞损伤。 以上结果表明,在H2O2所致大鼠心肌细胞损伤中,Hsc70对H2O2所致的大鼠心肌细胞损伤具有保护作用。 综上所述,Hsc70是一个重要的内源性保护蛋白,在心肌缺血-再灌注损伤中发挥重要保护作用。在缺血-再灌注损伤大鼠心肌及氧化应激的心肌细胞中,Hsc70与ENOA、GAPDH和ALDH2存在相互作用,并且Hsc70能够直接与ENOA、GAPDH结合。在大鼠H9c2心肌细胞氧化应激损伤时,代谢相关的GAPDH、ENOA和ALDH2活性均降低,这些酶活性的降低可能增加了心肌细胞对氧化应激导致的心肌损伤的易感性。而Hsc70可通过与GAPDH、ENOA和ALDH2相互作用,减轻活性氧所致后者活性的降低,从而保护氧化应激所致的心肌损伤。这可能是Hsc70在心肌缺血.再灌注损伤及氧化应激损伤时发挥抗损伤作用的重要机制。