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类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis,RA）是一种以侵蚀性、对称性多关节炎为主要临床特征的慢性、全身性自身免疫病。RA的基本病理改变是滑膜增生、炎症细胞浸润、关节翳形成以及关节软骨和骨基质破坏。成纤维样滑膜细胞（Fibroblast-like synoviocytes,FLS）是炎症性滑膜炎中组织损伤和基质重塑的直接效应细胞,在RA疾病发生发展过程中发挥了重要的作用。B7-H3（CD276）是一种重要的共刺激分子。研究表明,B7-H3在多种恶性肿瘤和自身免疫性疾病中异常表达,并与患者预后不良和疾病进展密切相关。此外,B7-H3在细胞增殖、迁移侵袭和细胞凋亡等多种生物学功能中发挥了重要的调节作用。由于B7-H3的受体尚未鉴定,其调控生物学功能的确切机制尚待进一步探讨。研究目的:本课题以B7-H3在RA患者滑膜组织FLS中的异常表达为切入点,旨在探讨B7-H3分子在FLS中的生物学功能及其可能的作用机制,为RA临床诊断和治疗提供新的分子靶点。研究方法:1.B7-H3分子在RA患者滑膜组织FLS中的表达及细胞定位:（1）通过流式细胞术检测RA滑膜组织中多种共刺激分子的表达;（2）通过western blot、real time-PCR分析B7-H3分子在滑膜组织中mRNA和蛋白水平的表达;（3）结合单细胞测序数据分析B7-H3分子在RA滑膜组织中的细胞定位;（4）通过免疫组织化学染色、流式细胞术检测B7-H3在炎性滑膜组织中的表达。2.B7-H3分子在RA-FLS中的生物学功能:（1）以原代培养的人RA-FLS细胞系为研究对象,通过siRNA沉默B7-H3表达并鉴定干扰效率;（2）通过cck8法检测B7-H3对细胞增殖的影响;（2）通过AnnexinV-PE/7AAD凋亡检测试剂盒分析B7-H3敲减后RA-FLS凋亡能力、细胞周期的变化;（3）通过CBA法检测B7-H3信号改变后FLS中炎性因子和趋化因子表达变化;（4）通过Transwell法检测RA-FLS对THP-1、PBMC的趋化能力的影响;（5）通过迁移实验、划痕实验和侵袭实验观察细胞体外迁移和侵袭的能力;（6）通过FN、matrix铺板法观察细胞体外黏附能力的变化。3.B7-H3分子调控FLS生物学功能的分子机制:（1）蛋白芯片分析B7-H3对RA-FLS蛋白表达的影响;（2）通过Western blot方法检测B7-H3对RA-FLS信号通路蛋白分子表达的影响。研究结果:1.B7-H3分子在RA患者滑膜组织FLS中的表达及细胞定位:（1）共刺激分子PD-L2和B7-H3在RA-FLS中上调表达;（2）RA滑膜组织中的B7-H3分子在mRNA水平的表达显著高于健康对照组（P＜0.05）;在蛋白水平的表达OA和健康对照组（P＜0.05）;（3）在RA滑膜组织中,B7-H3分子主要在FLS、单核巨噬细胞上异常高表达。2.B7-H3分子在FLS中的生物学功能:（1）成功建立并鉴定了 10株原代培养的RA-FLS并利用siRNA成功敲减细胞中B7-H3分子的表达;（2）B7-H3敲减后,与对照组相比,si1041组在48h（P＜0.01）、72h（P＜0.001）和96h（P＜0.001）时,FLS的细胞增殖水平显著降低;（3）B7-H3敲减后,与对照组相比,si996组和si1041组凋亡水平和细胞周期无明显改变;（4）B7-H3敲减后,与对照组相比,si996组FLS分泌的细胞因子IL-6（P＜0.01）和IL-8（P＜0.001）显著降低,趋化因子 CXCL8（P＜0.001）、CCL5（P＜0.01）、CCL2（P＜0.01）和CXCL10（P＜0.05）显著降低,而si1041组仅趋化因子CCL2降低（P＜0.05）;（5）B7-H3敲减后,与对照组相比,si996组和si1041组FLS细胞招募的THP-1（P＜0.05）和PBMC（P＜0.001）细胞数量显著减少,即B7-H3下调后,RA-FLS对THP-1和PBMC的趋化能力降低;（6）细胞迁移和侵袭实验结果表明,B7-H3敲减后,与对照组相比,si996和si1041组中 RA-FLS 的细胞迁移显著降低（P＜0.01）;si996（P＜0.05）和 si1041 组（P＜0.01）侵袭能力均降低;（6）B7-H3敲低后,与对照组相比,si996和si1041组中FLS对FN的粘附能力显著降低（P＜0.01和P＜0.001）,si996和si1041组中FLS对matrix胶的粘附能力显著降低（P＜0.001）。3.B7-H3分子调控FLS生物学功能的分子机制:（1）差异基因KEGG pathway富集分析结果表明,与对照组细胞相比,si996组RA-FLS中负责细胞间粘附、白细胞迁移、趋化相关蛋白显著下调,si1041组RA-FLS负责调控白细胞迁移、细胞间粘附、胞外基质和结构重组、细胞趋化、酪氨酸激酶相关STAT蛋白信号通路显著下调;（2）Western blot试验显示,在RA-FLS中沉默B7-H3表达后,多种信号蛋白显著下调,B7-H3分子可能通过活化的c-Met和mTOR信号,激活下游靶蛋白从而参与RA-FLS多种生物学功能的调控。研究结论:B7-H3在RA滑膜组织的FLS中异常表达,且在RA-FLS的细胞增殖、迁移侵袭、粘附、趋化和细胞因子分泌等多种生物学功能中发挥重要作用,其调控机制可能与活化的c-Met和mTOR信号有关。