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第一部分构建稳定低表达B7-H3的大肠癌细胞以及基因芯片检测目的 检测六种常见的人大肠癌细胞株的B7-H3分子的表达水平。构建稳定低表达B7-H3的大肠癌单克隆细胞株,研究B7-H3水平下降后细胞内其他基因表达情况的改变。研究各shB7-H3克隆株中B7-H3与HB-EGF的表达水平。方法 流式细胞分析以及qPCR检测六种常见的人大肠癌细胞株的B7-H3的表达水平。在DLD-1以及RKO细胞株中,通过B7-H3干扰慢病毒转染以及单克隆挑选实验,构建稳定低表达B7-H3的单克隆细胞株shB7-H3 DLD-1、shB7-H3 RKO,流式细胞分析检测其B7-H3的敲减表达程度。选择合适细胞株进行基因芯片检测,生物学软件分析得到差异表达基因,GO（Gene Ontology）以及KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）分析差异表达基因富集的生物学功能与信号通路。qPCR检测分析各shB7-H3 DLD-1/RKO克隆株的B7-H3与HB-EGF的表达水平及相关趋势。结果 流式细胞分析显示B7-H3在6株人大肠癌细胞中的荧光强度均超过95%;qPCR显示各细胞株B7-H3的mRNA含量均较高。B7-H3的表达在各shB7-H3 DLD-1、shB7-H3 RKO单克隆细胞株中的均有不同程度的稳定敲减,且都为单细胞来源的单克隆细胞株。RKO的Control组与shB7-H3组的基因芯片结果经生物软件分析,取P＜0.05,|Log Fold Change|＞2为差异表达基因,Control组与shB7-H3组相比,随着B7-H3的表达相对提升,共同表达上调基因含HB-EGF、KRAS等,表达下调基因有GRPR、IL-7R等。GO分析表明,差异表达基因的生物学功能主要富集在蛋白磷酸化调控（GO:0001933）、血管生成的调控（GO:1901342）、Ras信号蛋白信号传导的调控（GO:0046578）、肝素结合能力（GO:0008201）等（均P＜0.05）。KEGG分析的结果表明,差异表达的基因富集于7个通路,包括PI3K-AKT信号通路、胰岛素抵抗信号通路、肿瘤坏死因子信号通路等（均P＜0.05）。在得到的各shB7-H3 DLD-1/RKO克隆株中,B7-H3的表达均得到不同程度的敲减,同时HB-EGF的表达水平也呈低表达,二者差异均有统计学意义（均P＜0.05）。结论 B7-H3的表达在六种常见的人大肠癌细胞水平均较高。成功构建了低表达B7-H3的shB7-H3 DLD-1、shB7-H3 RKO单细胞克隆株。基因芯片结果提示B7-H3与HB-EGF表达呈正相关性,提示B7-H3可能通过传导胞内信号上调HB-EGF发挥生物学作用,促进大肠癌的发生发展。第二部分 B7-H3与HB-EGF在大肠癌中的表达及其临床意义目的 研究大肠癌组织中B7-H3与HB-EGF的表达与临床病理特征之间的关系。方法 收集50例大肠癌患者的肿瘤组织和癌旁正常组织以及临床信息,以及20结肠腺瘤患者经肠镜切除的腺瘤组织。免疫组化（IHC）S-P法检测正常癌旁组织、腺瘤组织、肿瘤组织中的B7-H3与HB-EGF的蛋白表达情况;实时逆转录聚合酶链反应RT-qPCR（以下简称qPCR）检测正常癌旁组织、肿瘤组织中的B7-H3与HB-EGF的mRNA的表达水平,分析其在不同组织中的表达差异、相关性以及与临床病理之间的关系。结果 在本组的50组大肠癌以及20结肠腺瘤病例中,肿瘤组织中B7-H3与HB-EGF蛋白和mRNA的阳性表达率明显高于癌旁正常组织与腺瘤组织,差异具有统计学意义（P＜0.05）,B7-H3与HB-EGF的mRNA水平在肿瘤组织中具有显著的正相关性,具有统计学意义（R=0.607,P＜0.005）。大肠癌肿瘤组织中,B7-H3与HB-EGF的表达水平分别与大肠癌患者的性别、年龄、肿瘤直径、肿瘤分化程度均无明显相关性。TNM分期、淋巴结转移、局部浸润分别与B7-H3与HB-EGF的表达呈正相关,分期越晚,B7-H3与HB-EGF的表达水平越高,差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论 大肠癌患者的肿瘤组织中的B7-H3与HB-EGF的表达水平比癌旁正常大肠组织高。在肿瘤组织中,B7-H3与HB-EGF的表达具有正相关性,而且二者的表达分别与患者临床病理特征的不良指标相关;第三部分B7-H3通过PI3K-AKT-mTOR-HIF-1α轴促进HB-EGF的表达并促进大肠癌侵袭转移目的 通过生物软件预测分析结合HB-EGF启动子区域的转录因子,研究HIF-1α对HB-EGF的转录调控作用以及对大肠癌的促进作用。研究B7-H3胞内信号传导的具体机制。方法 分析基因芯片结果,运用NCBI、UCSC、JASPR等网站预测分析可能调控 HB-EGF 的转录因子。Western-Blot 及 qPCR 检测 Control RKO、shB7-H3 RKO中缺氧因子 1α（Hypoxia Inducible Factor 1 alpha,HIF-1α）以及 B7-H3 的表达水平。染色质蛋白免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation,ChIP）实验研究B7-H3表达水平下降后,HIF-1α与HB-EGF启动子区域结合水平的改变。对shB7-H3 RKO瞬时转染过表达HIF-1α慢病毒,构建HIF-1α过表达的shB7-H3 Oe-HIF-1α RKO细胞,qPCR分析HIF-1α表达水平上升后,引起的HB-EGF表达水平的改变。通过Transwell细胞侵袭实验、细胞增殖实验、血管生成实验,研究HIF-1α表达水平上升后,引起的HB-EGF的表达增加对于大肠癌细胞侵袭、增殖、转移功能的改变。Western-Blot检测PI3K-AKT-mTOR通路蛋白表达水平的改变以及p-AKT、p-mTOR磷酸化水平的改变,研究B7-H3的胞内信号通路。结果 经初步预测分析,可能与HB-EGF启动子区域结合的相关转录因子包括:HIF-1α、Nr2f6、NR2C2、JUN、MAZ等,其中HIF-1α评分较高且在差异表达基因列表中。Western-Blot及qPCR检测显示,与Control DLD-1/RKO相比,shB7-H3 DLD-1/RKO中的HIF-1α与B7-H3的蛋白与mRNA水平同步显著降低,差异具有统计学意义（均P＜0.05）。ChIP实验提示HIF-1α与HB-EGF启动子区域的结合位置约在其上游-1091～1043bp的位置,且在shB7-H3 DLD-1/RKO中,B7-H3表达水平下降后,HIF-1α与HB-EGF启动子区域的结合明显降低。当shB7-H3 DLD-1/RKO中HIF-1α表达水平经补回提升后,HB-EGF的表达水平也得到明显回升,差异具有统计学意义（P＜0.05）,大肠癌肿瘤细胞的增殖、侵袭、血管生成能力也得到明显回升,差异均具有统计学意义（均P＜0.05）。Western-Blot结果表明,在shB7-H3 RKO中,PI3K、AKT、mTOR蛋白表达水平以及AKT、mTOR的磷酸化水平均显著降低,灰度值差异均具有统计学意义（均P＜0.05）。结论 B7-H3可能通过PI3K-AKT-mTOR-HIF-1α轴传导胞内信号,促进HE-BGF的表达,HIF-1α作为通路最终的转录因子,调控HB-EGF基因的转录,促进HB-EGF的表达,最终介导大肠癌肿瘤的增殖侵袭转移,促进肿瘤的进展。