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研究目的甲状腺相关眼病(Thyroid-associated ophthalmopathy,TAO)是一类与甲状腺功能异常相关的自身免疫性疾病。尽管其具体的病因和发病机制尚不明确,但目前已证实转化生长因子β(Transforming growth factor-β,TGF-β)对眼眶成纤维细胞(Orbital fibroblasts,OFs)的诱导在TAO患者后期视物重影、眼球运动受限的发病机制中占有重要地位。在之前的研究中,我们通过比对TAO患者与正常人眼眶脂肪结缔组织高通量测序结果,锁定了其中一个差异性表达的蛋白——穿透素3(Pentraxin3,PTX3)。已有研究证明,PTX3在人体多个纤维化相关疾病中发挥了重要作用,但其在TAO患者眶内与TGF-β的关系以及相关纤维化进程中的作用尚不清楚。本研究以原代培养的人OFs为研究对象,第一部分计划体外应用TGF-β1刺激OFs,分别检测细胞PTX3蛋白水平和基因水平的表达变化,意图探究TGF-β1对OFs表达PTX3的作用和作用方式。通过TAO组和对照组的对比,探究其效应是否存在TAO疾病特异性。此外,我们拟采用特异性抑制剂和小干扰RNA(si RNA)阻断TGF-β/Smad信号通路中的相关受体和信号分子,观察PTX3 mRNA表达变化,以探索TGF-β1调节PTX3表达的具体分子机制。第二部分拟应用人重组PTX3蛋白(rhPTX3)干预TGF-β1对OFs的诱导过程,观察细胞形态改变及检测纤维化相关指标表达变化,尝试探索PTX3对TGF-β诱导的眶内纤维化进程的影响。研究方法1、用TGF-β1刺激OFs,通过Western Blot和ELISA分别检测细胞内外PTX3蛋白表达量的变化。2、用TGF-β1分别刺激TAO患者和对照组OFs,通过qRT-PCR检测PTX3mRNA表达量的变化。3、利用TGF-β受体抑制剂SB431542和rTβRII-Fc合并TGF-β1刺激OFs,qRT-PCR检测PTX3 mRNA表达量的变化。4、利用特异性Smad2/3磷酸化抑制剂ITD-1合并TGF-β1刺激OFs,qRT-PCR检测PTX3 mRNA表达量的变化;此外,将Smad4蛋白特异性si RNA转染入OFs,验证Smad4敲减成功后,给予TGF-β1刺激,qRT-PCR检测PTX3 mRNA表达量的变化。5、采用rhPTX3和TGF-β1共同刺激OFs,利用特异性抗体标记纤维化相关蛋白α-SMA,免疫荧光显微镜显示OFs的纤维化程度变化。6、采用rhPTX3和TGF-β1共同刺激OFs,通过qRT-PCR检测纤维化相关蛋白(α-SMA,Col Iα1,IL-6)mRNA表达量的变化。结果1、TGF-β1刺激OFs后,PTX3蛋白的表达随时间增加逐渐被抑制。2、TGF-β1可以在转录前水平抑制OFs的PTX3表达,呈现时间依赖性和浓度依赖性,且其抑制效应在TAO患者和对照组之间没有明显差异。3、SB431542可完全阻断TGF-β1对PTX3的抑制作用,而rTβRII-Fc仅能减弱一部分抑制效应。4、ITD-1可以完全抵消TGF-β1对PTX3的抑制作用;Smad4 si RNA(si Smad4)转染OFs后,Smad4 mRNA表达被成功抑制。Smad4敲减OFs的PTX3表达量无法被TGF-β1抑制。5、TGF-β1可诱导OFs的α-SMA蛋白表达量增加,细胞呈现纤维化改变,而rhPTX3对该效应未见明显抑制作用。6、TGF-β1可诱导OFs纤维化相关蛋白(α-SMA,Col Iα1,IL-6)的mRNA表达上调。rhPTX3对OFs表达α-SMA的mRNA无明显诱导作用,但共刺激时可显著增强TGF-β1对α-SMA的上调效应。rhPTX3可上调Col Iα1和IL-6 mRNA的表达,共刺激时可增强TGF-β1对IL-6的诱导上调,但对Col Iα1的上调未见明显影响。结论1、TGF-β1可以在转录前水平抑制OFs表达PTX3,抑制效应呈现时间依赖性和浓度依赖性,且该抑制作用在TAO患者来源的OFs和对照组之间没有明显差异,说明该抑制作用可能不存在TAO疾病特异性。2、SB431542、rTβRII-Fc、ITD-1以及si Smad4均可阻断上述抑制效应,说明TGF-β1抑制PTX3是通过TβRI-Smad2/3-Smad4信号通路完成的。3、rhPTX3对TGF-β1诱导的OFs纤维化过程具有潜在的促进作用,说明PTX3可能参与了TAO患者后期视物重影的发病过程,并发挥了正面作用。