论文部分内容阅读
表面增强拉曼散射(Surface-Enhanced Raman Scattering，SERS)是一种振动光谱技术。基于SERS的免疫检测技术，具有检测灵敏度高和特异性强等优点，已经广泛应用于核酸、蛋白质、细菌、细胞、重金属等检测领域。基于SERS的免疫检测技术通常包括:SERS-侧流免疫层析检测技术、SERS-免疫芯片检测技术和SERS-免疫磁珠检测技术。近年来，由于对同类疾病或者物质同时检测的需要，基于SERS免疫检测新技术的高通量研究逐渐成为人们关注的热点。SERS-侧流免疫层析检测技术和SERS.免疫磁珠检测技术难以实现高通量检测，SERS-免疫芯片检测技术可以实现高通量检测，但是基于金/银膜基底的SERS-免疫芯片价格昂贵，基于普通石英玻璃基底的免疫芯片无SERS增强能力，检测灵敏度低。
本文建立了用于高灵敏检测肺炎支原体感染的SERS-侧流免疫层析检测新技术，利用实验室研制的高通量SERS-侧流免疫层析仪器研究了6种新突发传染病的集成化检测。同时，制备具有催化底物功能的SERS检测探针(SERS tags)，建立了基于硅片基底的SERS免疫检测新技术，达到了高灵敏检测的目的。利用固态硅片基底制备SERS-免疫芯片，结合金标银染技术，实现了7种呼吸道传染病的高灵敏和多通道检测。主要研究内容如下:
1.建立了基于双层拉曼分子标记金核银壳纳米颗粒(Au@Ag NPs)的SERS-侧流免疫层析检测肺炎支原体感染的方法。
平均粒径为35nm左右的金纳米颗粒(Au NPs)作为种子，吸附拉曼分子DTNB制备Au/DTNB NPs，包被5nm左右的银壳，生成44nm左右的Au/DTNB@Ag NPs，再吸附DTNB，制备双层拉曼分子标记的Au/DTNB@Ag/DTNB NPs。利用双层拉曼分子标记的Au@Ag NPs作为SERStags，制备用于检测人IgM和肺炎支原体特异性IgM的SERS-侧流免疫层析试纸条，通过检测检测线上的SERS信号来定量和高灵敏检测人IgM以及肺炎支原体特异性IgM血清标本。基于Au/DTNB@Ag/DTNB NPs的SERS-侧流免疫层析试纸条定量检测人IgM，其检测限为0.1ng/mL，其检测灵敏度比可视化(10ng/mL)提高了100倍。肺炎支原体特异性SERS-侧流免疫层析试纸条检测20例肺炎支原体特异性IgM阳性血清标本和10例阴性血清标本，其检出率为100％，高出酶联免疫吸附试验(EUSA)15％。
2.研究了高通量SERS-侧流免疫层析仪在新突发传染病检测中的应用。
本实验室研制的高通量SERS-侧流免疫层析仪器包括可容纳6条侧流免疫层析试纸条的多通道免疫层析柱、激光器、拉曼光谱仪、旋转电机、信息采集软件等。所检测6种新突发传染病包括登革热病毒、黄热病毒、西尼罗河病毒、寨卡病毒、埃博拉病毒和腺病毒。基于前期已优化好的Au/DTNB@Ag/DTNB NPs制备了6种新突发传染病特异性SERS-侧流免疫层析试纸条，并装入多通道侧流免疫层析柱中。高通量SERS-侧流免疫层析仪器检测登革热病毒、黄热病毒、西尼罗河病毒和腺病毒的特异性抗原，其检测限为0.1ng/mL，其检测灵敏度比可视化(10ng/mL)提高100倍。检测埃博拉病毒和寨卡病毒的特异性抗原，其检测限为0.05ng/mL，其检测灵敏度比可视化(5ng/mL)提高100倍。并且，6种新突发传染病之间无交叉反应，试纸条均具有良好的特异性。
3.建立了基于新型SERS Tag的免疫检测新方法。
以醛基化固态硅片为检测基底，建立基于新型SERS tags的SERS免疫检测新技术。合成新型化合物DTNB-Tyr，制备新型SERS tags(Au-DTNB-Tyr NPs)，DTNB可以提供拉曼信号，酪胺(Tyr)可以被辣根过氧化物酶(Hrp)催化，引起SERS tags发生沉积。在硅片基底上进行双抗体夹心免疫检测人IgM，引入检测二抗(羊抗人IgM-HRP)，HPR催化新型SERS tags(Au-DTNB-Tyr NPs)沉积，结合金标银染技术放大SERS信号，达到了高灵敏和定量检测人IgM的目的，其检测限为0.01ng/mL。与化学发光免疫芯片相比，其检测灵敏度提高了将近1000倍。新型SERS tags的引入，在一定程度上避免了免疫结合和空间位阻导致SERS tags结合量少的现象。
4.研究了SERS-免疫芯片在呼吸道传染病检测中的应用。
制备用于检测7种呼吸道病原体抗原的sERS-免疫芯片，7种呼吸道病原体包括:甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒2型、肺炎支原体、呼吸道合胞病毒、腺病毒和天然肺炎链球菌。以检测抗体与拉曼分子DTNB偶联的Au NPs作为SERS tags，采用双抗体夹心SERS免疫方法检测呼吸道病原体抗原。由于制备SERS-免疫芯片的醛基化硅片基底无SERS增强能力，免疫反应区域SERStags的SERS增强能力有限，故引用金标银染技术对SERS tags进一步增强和放大信号。通过控制银染时间，达到了多通道、高灵敏和定量检测7种呼吸道病原体抗原的目的，其检测限均为0.1ng/mL。检测26例甲型流感病毒鼻咽拭子阳性标本和102例阴性标本，总相符率为95.31％。检测5例乙型流感病毒鼻咽拭子阳性标本和67例阴性标本，总相符率为97.22％。
本文建立了用于高灵敏检测肺炎支原体感染的SERS-侧流免疫层析检测新技术，利用实验室研制的高通量SERS-侧流免疫层析仪器研究了6种新突发传染病的集成化检测。同时，制备具有催化底物功能的SERS检测探针(SERS tags)，建立了基于硅片基底的SERS免疫检测新技术，达到了高灵敏检测的目的。利用固态硅片基底制备SERS-免疫芯片，结合金标银染技术，实现了7种呼吸道传染病的高灵敏和多通道检测。主要研究内容如下:
1.建立了基于双层拉曼分子标记金核银壳纳米颗粒(Au@Ag NPs)的SERS-侧流免疫层析检测肺炎支原体感染的方法。
平均粒径为35nm左右的金纳米颗粒(Au NPs)作为种子，吸附拉曼分子DTNB制备Au/DTNB NPs，包被5nm左右的银壳，生成44nm左右的Au/DTNB@Ag NPs，再吸附DTNB，制备双层拉曼分子标记的Au/DTNB@Ag/DTNB NPs。利用双层拉曼分子标记的Au@Ag NPs作为SERStags，制备用于检测人IgM和肺炎支原体特异性IgM的SERS-侧流免疫层析试纸条，通过检测检测线上的SERS信号来定量和高灵敏检测人IgM以及肺炎支原体特异性IgM血清标本。基于Au/DTNB@Ag/DTNB NPs的SERS-侧流免疫层析试纸条定量检测人IgM，其检测限为0.1ng/mL，其检测灵敏度比可视化(10ng/mL)提高了100倍。肺炎支原体特异性SERS-侧流免疫层析试纸条检测20例肺炎支原体特异性IgM阳性血清标本和10例阴性血清标本，其检出率为100％，高出酶联免疫吸附试验(EUSA)15％。
2.研究了高通量SERS-侧流免疫层析仪在新突发传染病检测中的应用。
本实验室研制的高通量SERS-侧流免疫层析仪器包括可容纳6条侧流免疫层析试纸条的多通道免疫层析柱、激光器、拉曼光谱仪、旋转电机、信息采集软件等。所检测6种新突发传染病包括登革热病毒、黄热病毒、西尼罗河病毒、寨卡病毒、埃博拉病毒和腺病毒。基于前期已优化好的Au/DTNB@Ag/DTNB NPs制备了6种新突发传染病特异性SERS-侧流免疫层析试纸条，并装入多通道侧流免疫层析柱中。高通量SERS-侧流免疫层析仪器检测登革热病毒、黄热病毒、西尼罗河病毒和腺病毒的特异性抗原，其检测限为0.1ng/mL，其检测灵敏度比可视化(10ng/mL)提高100倍。检测埃博拉病毒和寨卡病毒的特异性抗原，其检测限为0.05ng/mL，其检测灵敏度比可视化(5ng/mL)提高100倍。并且，6种新突发传染病之间无交叉反应，试纸条均具有良好的特异性。
3.建立了基于新型SERS Tag的免疫检测新方法。
以醛基化固态硅片为检测基底，建立基于新型SERS tags的SERS免疫检测新技术。合成新型化合物DTNB-Tyr，制备新型SERS tags(Au-DTNB-Tyr NPs)，DTNB可以提供拉曼信号，酪胺(Tyr)可以被辣根过氧化物酶(Hrp)催化，引起SERS tags发生沉积。在硅片基底上进行双抗体夹心免疫检测人IgM，引入检测二抗(羊抗人IgM-HRP)，HPR催化新型SERS tags(Au-DTNB-Tyr NPs)沉积，结合金标银染技术放大SERS信号，达到了高灵敏和定量检测人IgM的目的，其检测限为0.01ng/mL。与化学发光免疫芯片相比，其检测灵敏度提高了将近1000倍。新型SERS tags的引入，在一定程度上避免了免疫结合和空间位阻导致SERS tags结合量少的现象。
4.研究了SERS-免疫芯片在呼吸道传染病检测中的应用。
制备用于检测7种呼吸道病原体抗原的sERS-免疫芯片，7种呼吸道病原体包括:甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒2型、肺炎支原体、呼吸道合胞病毒、腺病毒和天然肺炎链球菌。以检测抗体与拉曼分子DTNB偶联的Au NPs作为SERS tags，采用双抗体夹心SERS免疫方法检测呼吸道病原体抗原。由于制备SERS-免疫芯片的醛基化硅片基底无SERS增强能力，免疫反应区域SERStags的SERS增强能力有限，故引用金标银染技术对SERS tags进一步增强和放大信号。通过控制银染时间，达到了多通道、高灵敏和定量检测7种呼吸道病原体抗原的目的，其检测限均为0.1ng/mL。检测26例甲型流感病毒鼻咽拭子阳性标本和102例阴性标本，总相符率为95.31％。检测5例乙型流感病毒鼻咽拭子阳性标本和67例阴性标本，总相符率为97.22％。