桑树MaGR基因的克隆及功能研究

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谷胱甘肽还原酶(Glutathione reductase, GR, EC 1.6.4.2)是抗坏血酸-谷胱甘肽(AsA-GSH)循环中一种重要的氧化还原酶类,广泛参与调控植物生长、发育和响应环境胁迫。桑树(Morus abla L.)作为一种多年生的经济林木,被越来越多地应用于生态保护方面,其自身也常常遭受各类逆境胁迫。目前,GR家族成员已从许多植物中克隆得到,同时也在部分植物中进行了功能研究,但是桑树MaGR的克隆及功能分析还未见报道。本研究利用RT-PCR技术克隆得到两个桑树的GR基因,命名为MaGR1和MaGR2,并对其进行生物信息学分析,亚细胞定位分析,时空表达和诱导表达分析及抗逆功能的研究,主要得到以下结果:
  1、MaGR基因的克隆及生物信息学分析。MaGR1和MaGR2的序列长度分别为1491bp和1677bp,编码的氨基酸序列包含有GR蛋白典型结构域如氧化还原活性位点,GSSG和NADPH结合位点等;MaGR1和MaGR2分别属于胞质亚型组和叶绿体亚型组;MaGR与AtGR的基因结构相似,含有相同数量的外显子和内含子,但两者的外显子和内含子位置和长度不同。
  2、MaGR的亚细胞定位及表达分析。亚细胞定位显示MaGR1蛋白定位于细胞质,细胞膜和细胞核,MaGR2蛋白主要位于叶绿体;qRT-PCR分析结果表明MaGR2的表达具有昼夜节律性,MaGR1在一天内不同时间点的表达水平没有明显规律;MaGR1和MaGR2在根,茎,叶片,雄花,雌花和幼果中均表达,且在叶片中高表达;两个MaGR基因对干旱,甲基紫精,低温和高温胁迫均有不同程度的响应,随着处理时间的延长其表达水平普遍呈现先上升后下降的趋势。
  3、MaGR转基因拟南芥的抗逆性研究。构建pCaMV35s::MaGR-eGFP过表达载体并转化拟南芥,分析转基因拟南芥的抗逆性。过表达MaGR2后提高了拟南芥对干旱的耐受性。不同浓度的甘露醇处理下,超表达植株OE2较野生型植株WT根长更长;干旱胁迫下,OE2植株较WT植株积累了更少的ROS及MDA,具有更高的脯氨酸含量,抗氧化酶活性和AsA-GSH循环代谢活性,同时伴随着AtrbohD的表达受到诱导而AtWRKY40和AtMYB44的表达被抑制;NaCl处理下,OE2植株表现出更强的抗逆性。
  综上所述,受多种胁迫诱导的MaGR在桑树抗逆过程中发挥着重要作用,本研究丰富了植物GR的功能研究以及桑树的抗逆机理,为桑树种质资源开发利用奠定了理论基础。
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