背景：维生素D调节钙磷代谢的功能已被广泛认知,近些年来,研究者们发现了维生素D是通过与维生素D受体(vitamin D receptor, VDR)结合来调控200多种基因的表达,包括免疫调节、抗炎、抗纤维化、细胞增殖和分化等功能。VDR被发现分布于全身多器官组织,于是越来越多的研究者们开始关注到维生素D的骨骼外调节作用,包括糖尿病,肺结核,心血管疾病及肿瘤等。一项纳入了18项随机对照临床研究的Meta分析表明补充维生素D可降低人群的总死亡率。VitD是一种类固醇激素,主要通过日晒由皮肤合成或者饮食摄取,然后通过两次羟化合成其活性产物：第一步由肝脏羟化为25-羟维生素D [25(OH)D],然后被运输至肾脏被1-α羟化酶经过第二次羟化合成其最具活性的代谢产物—1,25二羟维生素D[1,25(OH)2D]。1,25(OH)2D与VDR有更高的结合力,因此更具备生物学活性,但它在人体内浓度低,且用于检测1,25(OH)2D的方法不稳定。因此,临床上通常通过检测其稳定且具有较长半衰期(2-3周)的中间代谢产物—25(OH)D来评估人体内的维生素D水平。因为肝脏在维生素D的代谢中起着重要的作用,所以越来越多的研究开始关注到维生素D与肝脏疾病之间的关系。有研究发现在基因1型病毒感染的慢性丙型肝炎患者的干扰素治疗中,维生素D缺乏与低持续病毒学应答(sustained virologic response, SVR)率及肝脏病理严重程度相关。但后来涉及不同基因型病毒感染患者的研究中,又出现有争议的结果。最近一个Meta分析得出的结果是慢性丙型病毒性肝炎患者血清维生素D水平缺乏与肝脏显著肝纤维化及抗病毒治疗低持续病毒学应答率有关。慢性乙型病毒性肝炎(CHB)是世界性的疾病,全球约有4亿人口受其困扰,也是我国肝细胞肝癌发生的最主要原因。在CHB的治疗方面,长期的抗病毒治疗持久抑制乙肝病毒复制是减轻肝脏损伤、延缓肝脏疾病进展、降低肝细胞肝癌的发生率的重要途径。根据既往的研究发现,基线时ALT水平较高、HBVDNA定量较低的患者更容易获得病毒学应答。但这些经典的预测病毒学应答的因素都是不可调节的,所以探索新的慢性乙型病毒性肝炎抗病毒治疗疗效的预测因素对于提高患者的应答率具有重要的意义。在慢性乙型病毒性肝炎领域,关于维生素D水平与肝脏病理及病毒学应答的关系尚未见报道。最近,德国一项研究发现慢性乙型病毒性肝炎患者血清维生素D水平也明显低于健康对照,且发现血清维生素D水平与乙肝病毒载量呈显著负相关。这项发现对于慢性乙型病毒肝炎的治疗有重要的启发作用。而来自香港的研究则发现基线维生素D水平低的患者终末期肝病及死亡的发生率高于维生素D水平正常的患者,研究者推测维生素D缺乏的患者病毒控制欠佳从而导致了病程进展较快。但是德国Farnik等的研究纳入的全是白色人种的患者,且分析中未纳入肝脏病理的结果,所以我们计划在中国南方的患者中对血清维生素D水平与乙肝病毒载量的相关性进行验证并进一步探索维生素D水平与肝脏病理严重程度之间的关系。此外,目前尚未有研究探索过血清维生素D水平对于慢性乙型病毒性肝炎患者抗病毒治疗疗效的影响,因此我们计划在我国多中心临床研究CHB人群中探索中维生素D水平与疾病特征的关系及血清维生素D水平对CHB患者抗病毒治疗疗效的影响,进一步探索维生素D在CHB治疗中的价值。方法：1.研究对象横断面研究共纳入242例患者,其中134例在入组时行肝活组织穿刺检查以评估肝脏病理的炎症分级和病理分期。纳入患者来源于南方医院肝病中心。血清采集于2009年8月至2011年10月,标本储存于-80℃低温冰箱。患者纳入标准为：(1)慢性乙型病毒性肝炎患者,即发现乙肝表面抗原(HBsAg)阳性大于等于6个月；(2)年龄18岁以上；(3)既往未接受过抗病毒药物或者干扰素治疗。排除标准：(1)进展期肝硬化(Child-Pugh评分>6分)；(2)诊断肝细胞肝癌或者甲胎蛋白(AFP)检测值≥ 50 ng/ml;(3)存在其它肝脏疾病或者混合感染(酒精性肝病、丙型肝炎病毒感染、丁型肝炎病毒感染、自身免疫性肝病、肝豆状核变性、血色素沉积)；(4)恶性肿瘤或者其它严重的慢性疾病。纵向研究队列来源于EFFORT研究,共有606例患者接受了1：1的随机分组进入替比夫定优化治疗组和替比夫定单药治疗组,其中560例患者完成了104周的随访。这项随机对照临床研究来自于全国24家中心,自2009年8月份开始入组患者,2012年3月随访结束,血清标本储存于-80℃低温冰箱。患者入组条件：(1)年龄18-65岁；(2)HBsAg P日性6个月以上；(3)HBeAg阳性；(4) HBV DNA> 5 log10 copies/ml;(5)ALT≥2且≤10 ULN。患者排除标准为：(1)合并有甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒或戊型肝炎病毒感染者；(2)合并人类免疫缺陷病毒感染者；(3)药物性肝病或酒精性肝病；(4)严重代谢性肝病或自身免疫性肝病者；(5)曾接受抗HBV干扰素和／或核昔(酸)类药物抗病毒治疗。研究符合赫尔辛基宣言,并经全部参加单位伦理委员会审核同意,所有研究对象签署知情同意书。2.血清生化学和病毒学检测生化学检测：采用Olympus AU5400全自动生化分析仪。病毒学检测：HBVDNA定量检测采用Cobas荧光定量PCR法分析,HBV血清标志物(HBsAg、 HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb)采用雅培Architect 12000平台,用微粒子化学发光法检测。3.HBV基因型的检测方法采用QIAGEN公司的血清抽提试剂盒(QIAmp DNA Blood Mini Kit)进行HBV DNA提取,所得HBV DNA可直接用于PCR法扩增HBV的S区扩增的PCR产物送至上海英潍捷基公司完成测序工作,然后根据序列比对和遗传距离分析结果进行基因分型。4.血清维生素D检测方法采用罗氏25-羟基维生素D检测试剂盒于罗氏Cobas 601机器平台上进行检测,其中反应方法为电化学发光法。5.肝穿刺术及肝组织病理学诊断肝穿刺术采用单人操作法,获取肝组织必须在1.5 cm以上(至少包括6个以上汇管区),标本用4%甲酸溶液固定。部分肝组织移入液氮中保存备用,剩余肝组织常规制片,HE及网状纤维染色。指定一位对患者生化以及病毒学结果均不了解的病理医师进行诊断。肝脏病理学诊断炎症活动度与纤维化分期参考Knodell炎症评分和Ishak纤维化评分。6.统计分析方法所有数据采用SPSS 18.0进行分析。计量资料以均数±标准差表示,计数资料以百分比(%)表示。两组之间计量资料比较应用两独立样本非参数检验中的Kruskal-Wallis检验,其中HBV DNA定量及HBsAg定量转换成对数值后再进行比较。两组之间计数资料比较采用χ2检验(Pearson chi-square检验或Fisher’s Exact Test)。首先应用单因素二分类Logistic回归分析与因变量相关的变量,然后再把统计后有意义的指标纳入到多因素二分类Logistic回归中分析与因变量相关的变量。只有各项变量指标完整的患者才能进入多因素回归分析。建立受试者工作特征(ROC)曲线的用于预测病毒学应答。所有统计分析基于双侧假设检验,以α=0.05为检验水准,p<0.05具统计学意义。结果1.横断面研究①研究对象基本资料根据上述的纳入和排除标准,共纳入242例初治慢性乙型病毒性肝炎患者。所有患者均来自中国广东省(约位于北纬23°)。其中有189例(78.1%)E抗原阳性患者,53例(21.9%)E抗原阴性患者。其中男性多于女性,E抗原阳性患者中82%为男性,E抗原阴性患者中85%为男性。E抗原阳性患者的谷丙转氨酶水平(ALT)高于E抗原阴性患者(157.00±78.09 vs.112.51±105.88 U/L)。无论是E抗原阳性患者(55.7%)还是E抗原阴性患者(66%)都是以B基因型HBV感染为主。②血清维生素D水平所有患者血清维生素D水平的平均值为33.90±10.67 ng/ml。59.9%慢性乙型病毒性肝炎患者的血清维生素D水平正常(>30 ng/ml)；31.4%的患者血清维生素D水平在20～30 ng/ml之间；8.7%的患者维生素D缺乏(<20 ng/ml).我们的研究中维生素D缺乏的比率明显低于来自欧洲的研究中维生素D缺乏的比率(46.4%～81%),但是和来自澳大利亚的研究结果(16%)相近。③不同维生素D水平患者的特征我们根据上述维生素D的界值(<20 ng/ml,20～30 ng/ml,>30 ng/ml)将患者分为了三组并比较了其临床特征。如表3所示,维生素D缺乏的患者(<20 ng/ml)年龄较小,血清肌酐及血红蛋白水平较低,多为女性且多为B基因型HBV感染,主要于秋冬季节抽血。而各组患者的身高体重指数(Body mass index, BMI)、白细胞数、血小板数、ALT、胆红素、白蛋白水平、凝血酶原时间、HBsAg定量及病毒基因型的构成均无明显差异。此外,不同组别患者的肝脏病理评分也未见差异。④影响血清维生素D水平的单因素和多因素分析为了进一步了解维生素D缺乏(<20 ng/ml)的影响因素,我们对可能存在的影响因素进行了单因素和多因素的回归分析。我们选择了年龄、性别、采血季节、BMI、血红蛋白、白细胞计数、血小板计数、ALT、胆红素、白蛋白、肌酐、凝血酶原时间、HBV基因型、E抗原状态、HBsAg定量、HBV DNA定量、肝脏炎症及纤维化评分作为自变量。在单因素分析中,性别(男vs.女,p=0.002)、年龄(p=0.009)、采血季节(冬春vs.夏秋,p=0.007)、肌酐水平(p=0.013)、HBV基因型(B vs.C,p=0.016)及E抗原状态(阳性VS.阴性)与维生素D水平相关。在多因素回归分析中,只有性别(p=0.009)、年龄(p=0.001)、采血季节(p=0.040)及病毒基因型(p=0.004)是维生素D水平的独立预测因素。由于上述结果发现HBV基因型与维生素D水平有关,我们根据病毒基因型(Bvs.C)将患者分为两组。基因B型HBV感染的患者组25(OH)D水平明显低于基因C型HBV感染患者组(32.51±11.06 vs.35.77±10.16 ng/ml,p=0.023,见图2.2)。此外,基因B型HBV感染的患者维生素D缺乏率明显高于基因C型HBV感染的患者(46.3% vs.30.6%,p=0.021)⑤维生素D与HBV DNA定量的关系为了进一步验证德国的研究中发现的维生素D水平与HBV DNA定量间的相关性,我们在自己的队列中对两者的关系进行了分析,但是并没有发现这两者之间存在相关性(r=-0.025,p=0.700)。当我们根据HBV DNA定量将患者分为两组：HBV DNA<6(n=44)和≥6 log10 copies/mL(n=198),两组间的维生素D水平(34.14±10.52 vs.33.73±10.74 ng/ml,p=0.920)及维生素D缺乏率(40.9% vs.39.9%,p=0.902)无明显差异。为了进一步探索维生素D水平与乙肝病毒定量之间的关系,我们分别在不同基因型HBV感染的患者中分析了两者之间的相关性,在基因B型HBV感染的患者(r=0.008,p=0.928)及C型HBV感染的患者(r=-0.052,p=0.612)中均未发现两者存在相关性。⑥维生素D与肝脏病理的关系242位患者中有134位进行了肝活组织穿刺检查。不同评分的患者分布情况如下：HAI 0～36.0%(n=8),HAI 4～69.O%(n=12), HAI 7～9 44.0%(n= 59),HAI≥10 41.0%(n=55);F1 6.0%(n=8),F2 28.4%(n=38),F3 35.8% (n=48),F4 20.1% (n=27), F5 7.5%(n=10)和F62.2%(n=3)。轻微肝炎活动和显著肝炎活动的患者间血清25(OH)D水平无明显差异(HAI 0.9 34.21±11.27 vs.HAI 10-18 31.94±10.98 ng/ml,p=0.219)。轻微肝纤维化和显著肝纤维患者间血清25(OH)D水平无明显差异(F1～2 33.04±11.41 vs.F3-6 33.40±11.10 ng/ml,p=0.907).此外,在轻微肝炎活动和显著肝炎活动的患者间(41.8% vs.50.9%,p=0.296)、轻微肝纤维化和显著肝纤维患者间(45.7% vs.45.5%,p=0.983),维生素D缺乏的比例也无明显差异。2.纵向研究①研究对象基本资料本研究共纳入了自2009年8月至2010年3月份中国多中心入组并完成104周随访的患者560例CHB患者,有6例患者血清量不足目前未完成维生素D的检测,因此最终纳入此次分析的人群是554例CHB患者。其中男性449例(81.0%),女性105例(19.0%),平均年龄30.19±8.97岁。患者的平均血清25(OH)D水平为29.82±11.20 ng/ml.54.5%(302/554)的患者血清维生素D不足(Vitamin D insufficiency,<30 ng/ml),45.5%(252/554)的患者血清维生素D处于正常水平(≥30 ng/ml).②纬度与维生素D水平的关系随着纬度(与赤道的距离)的升高,25(OH)D水平呈阶梯状下降：36.09±10.99 ng/ml(中国南方,N23°-28°),29.26±10.49 ng/mL(中国中部,N29°-36°),24.61 ±9.57 ng/mL(中国北方,N37°-43°),p<0.001。三个地区之间的维生素D缺乏率也存在统计学差异(32.4%,56.6%和72.7%,p<0.001)。③维生素D水平的影响因素：单因素和多因素回归分析为了进一步了解维生素D不足(<30 ng/ml)的影响因素,我们进行了单因素和多因素的回归分析。我们选择了年龄、性别、采血季节、纬度、BMI,基线指标为血红蛋白、白细胞计数、血小板计数、ALT、白蛋白、总胆红素、血肌酐、HBV基因型、HBV DNA定量、肝脏炎症活动分期及肝纤维化分级作为因变量。因为生化和血常规的检测都是在各中心的当地实验室完成,有不同的正常参考值,所以我们将数据按正常上限的倍数进行了调整。在单因素回归分析中,性别(男VS.女,p=0.001)、采血季节(冬春vs.夏秋,p=0.011)、纬度(p<0.001)和胆红素(p=0.008)是维生素D不足的影响因素。在多因素回归分析中,只有性别(男VS.女,p=0.001)、采血季节(冬春vs.夏秋,p=0.009)和纬度(p<0.001)是维生素D不足的影响因素。④病毒学应答的基线预测因素在对病毒学应答的影响因素的分析中,我们纳入了性别、患者基线的年龄、采血季节、纬度、BMI、ALT、HBV DNA定量、HBsAg定量及血清25(OH)D水平(≥30 vs.<30 ng/ml)作为自变量。在单因素回归分析中有显著意义的变量有ALT(p=0.005)、HBV DNA定量(p<0.001)、HBsAg定量(p<0.001)、治疗分组(p<0.001)和血清25(OH)D水平(≥30 vs.<30 ng/ml,p<0.001)；在多因素回归分析中只有ALT(p=0.021)、HBV DNA定量(p<0.001)、治疗分组(p<0.001)和血清25(OH)D水平(p<0.001)是病毒学应答的预测因素。⑤基线维生素D水平对病毒学应答的预测价值为了进一步评估基线ALT、HBV DNA定量和血清25(OH)D水平对病毒学应答的预测价值,我们做出了这三个指标对于预测慢性乙型病毒性肝炎患者治疗104周病毒学应答的ROC曲线。ALT、HBV DNA定量和血清25(OH)D水平评估病毒学应答的曲线下面积分别是0.589 p.0.001,95%CI:0.536-0.642). 0.668(p<0.001,95%CI:0.631-0.731).0.576(p=0.006,95% CI:0.525-0.627).根据约登指数计算维生素D最佳预测cut-of值为29.91 ng/ml,敏感度和特异度分别为0.510和0.685,阳性预测值和阴性预测值分别为81.8%和33.4%。结论：1.横断面研究发现：①中国广州地区维生素D缺乏(<20 ng/ml)的比例明显低于来自欧洲的研究中维生素D缺乏的比例(46.4%-81%),但是和来自澳大利亚的研究结果(16%)相近；②性别(OR=0.936,p=0.002)、年龄(OR=2.886,p=0.009)、采血季节(OR=1.809,p=0.007)及病毒基因型(OR=0.407,p=0.016)是患者血清维生素D水平的独立预测因素；③血清25(OH)D水平与乙肝病毒载量之间无明显相关性(r=-0.025,p=0.700),此外,在轻微肝炎活动和显著肝炎活动的患者间(41.8% vs.50.9%,p=0.296)、轻微肝纤维化和显著肝纤维患者间(45.7% vs.45.5%,p=0.983),维生素D缺乏的比例也无明显差异；④基因B型HBV感染的患者组25(OH)D水平明显低于基因C型HBV感染患者组(32.51±11.06 vs.35.77±10.16 ng/ml,p=0.023)；基因B型HBV感染的患者维生素D缺乏率明显高于基因C型HBV感染的患者(46.3% vs.30.6%,p=0.021)。2.多中心纵向研究发现：①中国地区有54.5% (302/554)的CHB患者血清维生素D不足(<30 ng/ml)；②血清维生素D水平在CHB人群分布随纬度变化呈梯度变化(中国南方vs.中国中部vs.中国北方,36.09±10.99 vs.29.26± 10.49 vs.24.61±9.57 ng/mL,p<0.001)；③性别(OR=2.192,p=0.001),采血季节(OR=0.646,p=0.011)和纬度(OR=0.181,p<0.001)是维生素D不足的影响因素；④治疗前ALT(OR=1.134,p=0.021)、HBV DNA定量(OR=0.421,p<0.001)、治疗分组(OR=0.436,p<0.001)和血清25(OH)D(OR= 0.404,p<0.003)是病毒学应答的预测因素；⑤治疗前血清25(OH)D水平可以预测CHB患者抗病毒治疗的病毒学应答,维生素D缺乏的患者病毒学应答率较低,血清25(OH)D水平评估病毒学应答的曲线下面积分别是0.576(p=0.006,95% CI：0.525-0.627)；根据约登指数计算维生素D最佳预测cut-of值为29.91 ng/ml。