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目的急性肺损伤（acute lung injury,ALI）是以严重的低氧血症、气道功能障碍与肺部失控的炎症反应为主要特征的临床危重症。目前主要依靠药物治疗和机械通气,药物治疗以抗炎治疗为主,如临床常用的地塞米松（Dexamethasone,DEX）、布洛芬、阿司匹林,尽管能在一定程度上控制炎症反应,但会引起各种不良的副作用。近年来,小分子天然产物为药物开发提供了大量的可利用资源,具有有效的生物活性。Chen等研究发现,具有抗ALI的天然产物在结构上有一些相似之处,大多含有α,β-不饱和羰基,这表明α,β-不饱和羰基可能是治疗ALI的重要药效基团。穿心莲（Andrographis paniculata（Burm.F.）Nees）为爵床科穿心莲属植物穿心莲的干燥地上部分,具有清热解毒、凉血消肿的功效。现代药理学研究表明,穿心莲具有抗炎、抗癌、抗血栓、抗流感病毒、抗动脉粥样硬化、抗菌、抗疟、肝保护等作用,其主要活性成分是以穿心莲内酯为代表的二萜内酯类成分。穿心莲内酯具有α,β-不饱和羰基结构且抗炎效果良好,体外研究发现,穿心莲内酯能剂量依赖性的抑制脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）诱导的ALI小鼠肺水肿、炎症细胞浸润、髓过氧化物酶（MPO）活性和促炎因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）的表达,体内实验对ALI亦具有良好的治疗作用。本课题组前期对穿心莲内酯成酯修饰合成穿心莲内酯衍生物ADA,本实验在前期研究基础上开展ADA对LPS诱导的小鼠急性肺损伤的保护作用研究并探究其抗炎作用机制,为临床治疗ALI提供候选药物。方法与结果1.ADA对LPS诱导的小鼠急性肺损伤的保护作用将70只KM雄鼠随机分为7组,每组10只。分别为对照组,LPS组,地塞米松组（DEX,5 mg/kg）,穿心莲内酯组（A,400 mg/kg）,ADA低、中、高（100、200、400 mg/kg）组,各给药组连续灌胃7天,1次/天,DEX组第5-7天腹腔注射地塞米松磷酸钠注射液。第7天给药1 h后,对照组腹腔注射0.9%生理盐水,LPS组及各给药组腹腔注射5 mg/kg LPS溶液。24 h后,处死小鼠,收集小鼠血液及组织进行检测。结果显示:（1）与正常组相比,LPS组小鼠体重明显下降(**P＜0.01),多数小鼠抱团蜷缩,懒动、精神萎靡、行为能力迟缓,少食;眼睑及眼眶周围存在明显的分泌物,小鼠肛门处多有粪便。各给药组造模前后体重无明显差异;（2）与LPS组相比,ADA给药组能降低小鼠的脾脏指数、肺脏指数和肺湿/干重（W/D）,降低小鼠全血白细胞、淋巴细胞、中性粒细胞含量,与A组、DEX组相比,高剂量的ADA处理组对肺脏指数、W/D、炎症细胞的抑制作用强于A和DEX;（3）ELISA法检测血清中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、单核蛋白趋化蛋白-1（MCP-1）等炎症因子的含量,结果显示,DEX组和A、ADA给药组均能不同程度降低炎症因子的含量,ADA低、中、高给药组抑制作用具有剂量依赖性,与A组、DEX组相比,高剂量的ADA对TNF-α、IL-1β、IL-6的抑制作用强于DEX,但DEX对MCP-1的抑制作用稍强,中、高剂量下ADA对炎症因子的抑制作用均强于A。（4）比色法检测肺组织中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、髓过氧化物酶（MPO）的含量,结果显示,与LPS组相比,ADA组SOD活性升高,MDA水平降低,且均呈现出剂量依赖性,与A组、DEX组相比,ADA高剂量组对MDA的抑制作用强于A组,对SOD的升高作用强于DEX。此外,各给药组均能不同程度的降低小鼠肺组织中MPO的含量,与A组、DEX组相比,中、高剂量的ADA对MPO的抑制作用强于A,与DEX组的作用结果一致。（5）PCR结果表明,与对照组相比,LPS组小鼠肺组织中TNF-α、IL-6的基因表达量显著升高,其扩增倍数分别为26.9倍、12.1倍;与LPS组相比,ADA给药组能剂量依赖性的抑制炎症因子表达量的增加;与A组、DEX组相比,中、高剂量的ADA对ALI小鼠肺组织中TNF-α、IL-6 m RNA的表达量的抑制作用强于A,高剂量的ADA对TNF-α、IL-6 m RNA的表达量的抑制作用强于DEX。（6）HE染色结果显示,LPS组小鼠肺泡结构被破坏,肺泡壁严重水肿,大量炎性细胞浸润,血管充血、出血。DEX组和A组肺泡壁水肿减轻,肺泡腔中渗出物明显减少,ADA组低、中、高给药剂量下,肺组织损伤程度逐渐减轻。综上所述,ADA可以保护脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤,且高剂量下ADA的抗炎效果强于穿心莲内酯和DEX。2.ADA对LPS诱导的RAW264.7细胞的保护作用（1）MTT法检测RAW264.7细胞活力,结果显示,A和ADA处理细胞24 h后,在0-5μM浓度范围内无细胞毒性;0-5μM的A、ADA预处理1 h,LPS诱导RAW264.7细胞24 h后,与对照组相比,细胞活力亦无明显影响。（2）Griess法检测NO的分泌水平,结果发现,LPS诱导24 h后NO的含量明显上升（34.92±0.66）,且对照组和LPS组相比有极显著性差异(###P＜0.001),ADA能剂量依赖性的抑制NO含量,5μM的ADA、A对NO的抑制率分别为46%、12%。（3）ELISA法检测TNF-α、IL-6、前列腺素E2（PGE2）等炎症因子的含量,结果表明,对照组和LPS组相比有极显著性差异(###P＜0.001),A和ADA均能剂量依赖性的抑制LPS诱导的TNF-α、IL-6、PGE2增加,且相同剂量下ADA的抑制作用更为显著。（4）DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧,结果表明,与对照组相比,LPS组的荧光强度明显增强,给药组具有明显的抑制作用。（5）JC-1荧光探针检测线粒体膜电位,结果表明,与对照组相比,LPS组的绿色荧光明显增强,红色荧光相对减弱,merge图中红绿荧光的相对比例明显减小,而给药处理后,A和ADA能抑制绿色荧光,表明A和ADA可以提高炎症状态下线粒体功能。3.ADA的抗炎机制研究（1）Q-PCR法检测TNF-α、IL-6、IL-1β、环氧合酶-2（COX-2）、诱导性一氧化氮合酶（i NOS）等炎症基因的表达量,结果显示,各实验组TNF-α、IL-6、IL-1β、COX-2、i NOS的c DNA有效扩增,扩增产物专一性良好。与对照组相比,LPS组极显著升高TNF-α、IL-6、IL-1β、COX-2、i NOS m RNA表达量(###P＜0.001);与LPS组相比,ADA给药组能不同程度的降低TNF-α、IL-6、IL-1β、COX-2、i NOS m RNA表达量,且呈剂量依赖性,A在5μM的给药浓度下对上述炎症因子m RNA表达量均无显著性差异,不具有统计学意义。（2）Western blot法检测ADA对NF-κB、MAPK等通路相关蛋白表达的影响,实验结果表明:（1）LPS诱导24 h后,与对照组相比,LPS组的COX-2和i NOS的蛋白表达量显著增加(###P＜0.001,##P＜0.01),与LPS组相比,ADA给药组COX-2和i NOS的蛋白表达量剂量依赖性降低,A在5μM的给药浓度下能抑制i NOS的表达（*P＜0.05）,但对COX-2的表达无显著影响。（2）LPS诱导6 h后,与对照组相比,LPS组p-IκB蛋白极显著增加(###P＜0.001),A、ADA能显著性降低蛋白表达,且呈剂量依赖性;IκBα和P65经LPS诱导后表达量明显降低,加药处理后能够提高蛋白表达量,与LPS组相比,ADA高剂量下具有极显著性差异,A与LPS组的差异不显著,不具有统计学意义。此外,LPS加药处理6 h后,LPS组细胞核中P65蛋白表达量明显增加,细胞浆中P65蛋白表达量明显降低,表明在炎症状态下细胞中P65蛋白由细胞浆转移至细胞核中,给药处理后,ADA极显著抑制P65的核移位,呈现出剂量依赖性。（3）LPS诱导RAW264.7细胞1 h后明显提高MAPK信号通路中p-p38、p-ERK、p-JNK等蛋白的表达量,ADA给药组具有不同程度的抑制作用,其中A对p-ERK蛋白的表达量与LPS组相比不具有统计学意义,而ADA可显著性抑制MAPK通路中p-p38、p-ERK、p-JNK等蛋白的表达量且呈剂量依赖性。（3）免疫荧光法检测NF-κB P65核易位,结果表明,与对照组相比,LPS组NF-κB P65的红色荧光明显增强,加药处理后,ADA给药组的NF-κB P65的荧光强度明显减弱,表明ADA可以抑制NF-κB P65核易位。结论ADA能保护LPS诱导的小鼠急性肺损伤,降低小鼠的肺脏指数、脾脏指数,降低小鼠全血白细胞、淋巴细胞、中性粒细胞含量,降低小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1的含量,升高ALI小鼠肺组织中SOD,降低MDA、MPO的含量,降低TNF-α、IL-6炎症基因的表达量,减轻炎症反应,起到肺保护作用,且高剂量下ADA的抗炎效果强于A和DEX。ADA能剂量依赖性的抑制RAW264.7细胞中炎症因子的分泌,有效抑制细胞中ROS产生,提高线粒体功能。抑制TNF-α、IL-6、COX-2、i NOS、IL-1β的m RNA表达,下调COX-2、i NOS、p-IκBɑ、p-p38、p-ERK、p-JNK等蛋白表达并抑制NF-κB p65核移位。表明ADA可能通过抑制NF-κB/MAPK信号通路激活发挥抗炎效果。综上所述,穿心莲内酯衍生物ADA通过抑制NF-κB/MAPK信号通路保护LPS诱导的急性肺损伤。