论文部分内容阅读
甲状腺癌是头颈部和内分泌系统中最常见的恶性肿瘤,发病率逐年急剧增加,并且预计该疾病将成为全球第四大癌症类型。目前,甲状腺癌的治疗方法多种多样,包括手术、放疗、化疗等,但这些治疗方法仍存在术后并发症、耐药性、疗效差或副作用严重等局限性。此外,普通的抗癌药物由于水溶性差、生物利用度低以及无靶向性等缺点,从而无法达到有效的抗肿瘤作用。因此,开发安全有效的药物和新的治疗策略是非常必要的。硫化氢（H2S）目前被广泛认为是第三种内源性气体信号分子,在癌症生物学过程中发挥着关键作用。一些研究表明H2S参与调节癌症生物学过程:内源性H2S或相对低水平的外源性H2S可能具有促癌作用,而较高剂量或较长时间暴露于H2S可能导致癌细胞死亡。透明质酸（HA）是一种由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖胺组成的线性多糖。HA除了具有良好的生物相容性、生物降解性、优异的亲水性、无毒无刺激性和非免疫原性等特征之外,它还具有识别肿瘤细胞表面过表达特异性受体的能力,因此常被用于靶向药物递送。通过将具有靶向性的HA偶联到抗肿瘤药物上可以提高药物的水溶性、在肿瘤组织的富集、以及疗效。由于甲状腺癌较高的病发率以及不良预后,研发一种安全、有效、靶向性强的新型药物来预防和治疗甲状腺癌,降低死亡率,这对于甲状腺癌患者意义深远。目的:将难溶性小分子硫化氢供体ADT-OH与HA通过酯化反应生成HA-ADT,在一定程度上提高了ADT-OH的靶向性、稳定性、溶解性以及生物利用度;然后对HA-ADT抑制人甲状腺癌细胞（ARO和TPC-1）的作用机制进行研究。方法:首先,将HA与硫化氢供体ADT-OH通过酯化反应得到HA-ADT。其次,为了验证HA-ADT药物的靶向性,通过化学反应得到荧光探针IR780-HA-ADT。然后,通过~1H-NMR对化合物的结构进行表征。体外实验:通过MTT、CCK-8和EDU染色实验来检测HA-ADT对人甲状腺癌细胞增殖的作用;通过划痕、Transwell、Invasion和Western blot实验来检测HA-ADT对人甲状腺癌细胞迁移和侵袭的作用;通过流式和Western blot检测HA-ADT对人甲状腺癌细胞周期进程的影响;通过TUNEL、YF?488-Annexin V/PI双染以及Western blot来检测HA-ADT对人甲状腺癌细胞凋亡的影响;通过Mito SOX染色检测HA-ADT对人甲状腺癌细胞线粒体内ROS的影响;通过罗丹明123（Rh123）染色检测HA-ADT对人甲状腺癌细胞线粒体膜电位的影响;通过MDC和Western blot来检测HA-ADT对人甲状腺癌细胞自噬的影响。体内实验:通过将人甲状腺癌细胞接种到裸鼠腋下来检测HA-ADT对人甲状腺癌细胞成瘤率的影响;通过活体成像和免疫组化（IHC）实验来检测HA-ADT对肿瘤的靶向性;通过HE染色以及免疫组化观察组织学形态;通过Western blot检测HA-ADT对人甲状腺癌细胞生长与自噬的影响;通过氧化应激实验说明HA-ADT抑制肿瘤生长与氧化应激的关系;通过分析荷瘤裸鼠的体重、脏器系数和脏器HE染色来评估HA-ADT的毒性。结果:1.从~1H-NMR结果来看,我们成功的合成了HA-ADT和荧光探针IR780-HA-ADT,HA-ADT与荧光探针IR780-HA-ADT接枝率分别约为28%和1%。2.MTT、CCK-8和EDU染色实验结果表明,HA-ADT组相较于其它组对人甲状腺癌细胞的活性和增殖具有明显的抑制作用。3.划痕、Transwell、Invasion和Western blot实验结果表明,与其它组相比,HA-ADT明显抑制了人甲状腺癌细胞的迁移与侵袭。4.细胞周期检测结果表明,与其它组相比,HA-ADT组显著地抑制了人甲状腺癌细胞的周期进程。5.TUNEL、YF?488-Annexin V/PI双染以及Western blot实验结果表明HA-ADT组相较于其它组对人甲状腺癌细胞的凋亡具有明显的促进作用。6.Mito SOX染色结果表明,与其它组相比,HA-ADT组显著地促进了人甲状腺癌细胞线粒体内ROS的释放。7.Rh123染色结果表明,与其它组相比,HA-ADT显著降低了肿瘤细胞的线粒体膜电位。8.MDC和Western blot结果表明,与其它组相比,HA-ADT组显著地促进了人甲状腺癌细胞的自噬。9.裸鼠成瘤实验结果表明,HA-ADT组相较于其它组的肿瘤体积明显减少。10.CD44和透明质酸酶-1的IHC以及活体成像结果表明,HA-ADT对甲状腺癌细胞具有靶向性。11.HE染色结果表明,与其它组相比,HA-ADT组细胞核减少,细胞间质增加。12.Ki67、MMP-2和MMP-9的免疫组化实验结果表明,与其它组相比,HA-ADT显著地抑制了肿瘤的增殖与迁移侵袭。13.肿瘤组织Western blot结果表明,与其它组相比,HA-ADT显著地抑制了肿瘤的生长并促进肿瘤细胞的自噬。14.氧化应激实验结果表明HA-ADT通过调节氧化应激来抑制甲状腺癌细胞的生长。15.裸鼠的体重、脏器系数和脏器HE染色结果表明HA-ADT具有安全无毒性。结论:我们成功合成了HA-ADT和荧光探针IR780-HA-ADT。体内外实验结果表明,与Control组、Na HS组和GYY41371组相比,HA-ADT具有靶向性强,水溶性好,安全有效等优点,且显著地抑制了人甲状腺癌细胞的活性、增殖、迁移侵袭和周期的进程,促进了人甲状腺癌细胞的凋亡与自噬。因此,我们的结论是,HA-ADT具有成为一种抑制甲状腺癌生长的新型靶向药物的潜力。