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慢性阻塞性肺病(COPD)和肺癌的患病率和致死率逐年攀升,带来了巨大的经济负担。流行病学研究表明慢阻肺是发展为肺癌的潜在危险因素,50-70%的肺癌患者患有慢性阻塞性肺病。吸烟是这两种疾病的共同病因,长期暴露在香烟烟雾中会导致气道发生病理改变。越来越多的证据表明上皮-间充质转化(EMT)和Th1/Th2细胞失衡等生物学过程是慢阻肺和肺癌病理生理的共同特征。因此抑制甚至逆转EMT过程和维持免疫功能(Th1/Th2细胞平衡),有望成为治疗慢阻肺和肺癌的新方法。中医药能调节慢性阻塞性肺病气道重塑和免疫应答,麦门冬汤具有滋养肺胃,化痰止咳的作用。麦冬皂苷D是麦门冬汤中重要的生物活性成分,具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抑制血栓的形成、镇咳等药理作用。研究表明,麦门冬汤和麦冬皂苷D在治疗肺部疾病和免疫方面具有广泛的应用前景,但是尚无有关它们如何调节慢阻肺和肺癌中EMT和Th1/Th2细胞平衡的报道,因此本研究旨在探讨麦门冬汤是否通过调节EMT和Th1/Th2细胞平衡来防治慢阻肺合并肺癌。本研究分为体内、体外、机制三个部分。Meta分析评估慢阻肺与肺癌生存率(OS)、无病生存率(DFS)和术后肺部并发症(PPCs)之间的关系。在体内研究中,紫外分光光度法测定麦门冬汤中麦冬皂苷D的含量。建立香烟烟雾和乌拉坦联合诱导的慢阻肺合并肺癌的小鼠模型,使用动物呼吸代谢测量系统检测潮气量以评价小鼠的肺功能;HE染色检测小鼠肺组织病理变化;记录小鼠肺部结节数;IR783检测肿瘤在肺部聚集情况;免疫印迹和RT-PCR检测肺组织中EMT蛋白及m RNA水平的表达;ELISA检测小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1的含量;血常规检测小鼠炎症细胞(WBC,Neutrophils,Lymphocytes)百分比;RT-PCR检测肺组织T-bet和GATA3 m RNA表达;双重免疫荧光组织化学染色检测肺组织中T-bet和GATA3表达;流式细胞术检测肺悬液中Th1和Th2细胞百分比,并计算Th1/Th2比值;ELISA检测Th1/Th2细胞因子的水平,以此来评价麦门冬汤和麦冬皂苷D防治慢阻肺合并肺癌过程中对EMT和Th1/Th2细胞的影响。在体外研究中,首先研究麦冬皂苷D对香烟烟雾提取物(Cigarette Smoke Extract,CSE)诱导A549细胞中EMT的影响,采用不同浓度的CSE和麦冬皂苷D分别处理A549细胞,MTT法检测CSE及麦冬皂苷D在48 h对细胞活性的影响;观察其对A549细胞的形态学变化;细胞划痕和Transwell小室分别观察A549细胞迁移和侵袭能力;免疫印迹和RT-PCR检测其对A549细胞上皮标志E-cadherin,间质标志N-cadherin、Vimentin、α-SMA蛋白和m RNA水平的变化。接着探索麦冬皂苷D对CSE诱导的Th1/Th2细胞失衡的影响,磁珠分离小鼠脾脏淋巴细胞得到CD4+T细胞,活化后采用不同浓度的CSE和麦冬皂苷D分别处理CD4+T细胞,MTT法检测CSE及麦冬皂苷D在48 h对细胞活性的影响;激光全息检测细胞的体积面积及迁移;DCFH-DA检测细胞ROS水平;JC-1和Mito-Tracker Green检测细胞的线粒体功能;ELISA检测Th1/Th2细胞因子的含量;免疫荧光和RT-PCR检测转录因子T-bet/GATA3表达的影响。在机制研究中,从GEO数据库中下载慢阻肺与正常肺组织样本、肺癌与正常肺组织样本的临床芯片;上皮间质转化基因数据库中下载上皮间质转化相关基因(ERGs);BATMAN-TCM筛选麦冬皂苷D相关靶点;利用KOBAS数据库对治疗靶点功能预测,筛选核心靶点和主要通路;免疫印迹验证c-Jun、MMP7和Wnt信号通路;通过小分子抑制剂,进一步验证探讨麦冬皂苷D调节EMT防治慢阻肺合并肺癌的机制。同时从GEO数据库下载Th1与Th2样本的临床芯片;免疫印迹验证NTRK1、ITGA4和PI3K-Akt信号通路;通过小分子抑制剂,进一步验证麦冬皂苷D调节Th1/Th2细胞平衡防治慢阻肺合并肺癌的分子机制。Meta分析结果显示,肺癌患者中慢阻肺的存在预示着更差的OS和DFS以及多种肺部并发症。体内研究结果显示,在香烟烟雾和乌拉坦诱导的慢阻肺合并肺癌小鼠模型中,第4周潮气量下降至20%以下,肺泡腔内可见炎症浸润,肺泡扩张。随着造模时间的推进,香烟烟雾和乌拉坦联合造模8周后,潮气量持续下降并且产生肺癌病灶,细胞结构破坏,细胞核严重凝聚。肺组织E-cadherin下调,N-cadherin、α-SMA、Vimentin上调;TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1促炎因子的含量和炎症细胞百分比增加;淋巴细胞浸润,以Th1淋巴细胞为主(T-bet+/CD4+),Th1/Th2比例增加;ELISA结果显示IFN-γ水平升高,IL-4水平降低,IFN-γ/IL-4比值升高。与模型组相比,麦门冬汤和麦冬皂苷D可以逆转EMT发生发展和Th1/Th2细胞失衡。体外研究结果显示,对于A549细胞,随着CSE浓度的增加,细胞活性降低;形状由多角形变为长梭形;细胞迁移及侵袭能力提高;A549细胞上皮标志E-cadherin下调,间质标志N-cadherin、α-SMA、Vimentin上调。麦冬皂苷D以剂量依赖性地改变A549细胞的形状由长梭形变为椭圆形,迁移及侵袭能力降低,上皮标志E-cadherin上调,间质标志N-cadherin、α-SMA、Vimentin下调。对于CD4+T细胞,CSE在不影响细胞增殖浓度范围内以剂量依赖方式增加细胞的体积面积和ROS水平,降低迁移能力和线粒体功能;增加Th1细胞因子IFN-γ的含量和转录因子T-bet的表达,减少Th2细胞因子IL-4的含量和转录因子GATA3的表达。麦冬皂苷D以剂量依赖方式逆转CSE引起的变化。机制研究结果显示:生物信息学分析麦冬皂苷D调节EMT防治慢阻肺合并肺癌的分子机制与c-Jun和MMP7以及Wnt信号通路有关。DKK-1小分子抑制剂验证c-Jun和MMP7是Wnt信号通路的下游靶点。同时麦冬皂苷D调节Th1/Th2细胞平衡防治慢阻肺合并肺癌的分子机制与NTRK1、ITGA4以及PI3K-Akt信号通路有关。使用DS-6051b、BIO1211和LY294002小分子抑制剂验证了NTRK1和ITGA4是PI3K-Akt信号通路的上游靶点。综上所述:麦门冬汤能够调节EMT和Th1/Th2细胞平衡防治慢阻肺合并肺癌,而其生物活性成分麦冬皂苷D既能调控Wnt信号通路及下游靶点抑制EMT进展,也能调节NTRK1和ITGA4干预PI3K-Akt信号通路逆转Th1/Th2细胞失衡。