红螯螯虾全长转录组测序及HSPs与CuZnSOD基因的克隆与表达分析

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红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)属节肢动物门,甲壳纲,十足目,拟螯虾科,光壳虾属,原产于澳大利亚,现已在我国广泛养殖,产生了巨大的经济价值。红螯螯虾在养殖过程中易受水产疾病的暴发和细菌的感染,使得其产业受到重大损失。但当前关于致病微生物胁迫下,红螯螯虾先天性免疫调控网络如何尚不清楚,因此,本研究进行了红螯螯虾全长转录组测序,克隆了红螯螯虾HSP 60、HSP 70、HSP 90等三种不同HSP基因和CuZnSOD基因的cDNA序列全长,对其进行信息学分析,并利用荧光定量PCR研究了四种基因在正常虾中不同组织和在溶藻弧菌、副溶血弧菌和嗜水气单胞菌侵染后鳃中的表达变化情况。主要研究结果如下:(1)分别提取正常红螯螯虾各组织的总RNA,进行Pac Bio Sequel测序,并通过生物信息学方法分析。共获得423407个聚合酶读取(21.24 Gb),平均读取长度为50165 bp,N50为83833 bp,CCS为366570个,全长非嵌合reads数(FLNC)为289232个,FLNC的平均长度为3717 bp;总共注释了13449个转录本,有12631个转录物被定位到354条KEGG途径,通过ANGEL软件鉴定编码序列,得到14220个编码序列并且8319个带有完整的ORF,使用BLASTN将所有预测的lnc RNA(4333)鉴定为平均长度为665.39 bp的lnc RNA,在所有测试的转录本中鉴定出21108个SSR,丰富和补充了红螯螯虾基因组信息。(2)红螯螯虾HSP 60基因cDNA全长为1731 bp,编码576个氨基酸,理论分子量为61.27 kda,等电点为5.23,含有一个六肽和八肽重复序列,C端含有ATP结合基序和典型的GGM重复基序;HSP 70基因c NDA全长为1932 bp,编码643个氨基酸,理论分子量为70.29 k Da,等电点为5.27,含有ATP/GTP结合位点、NLS-BP和EEVD基序;HSP 90基因c NDA全长为2199 bp,编码了732个氨基酸,理论分子量为84.47 k Da,等电点为4.89,包含Gxx Gx G基序、NLS-BP与一个MEEVD基序;CuZnSOD基因c NDA全长为501 bp,编码了166个氨基酸,理论分子量为17.05 kda,等电点为5.16,包含四个高度保守的铜锌结合位点。用进化树对比发现所克隆获得的红螯螯虾HSPs和CuZnSOD基因在不同动物中高度保守。(3)分别取红螯螯虾,提取各组织的总RNA,合成cDNA,并进行荧光定量表达分析,QRT-PCR结果表明红螯螯虾HSP 60、HSP 70、HSP 90和CuZnSOD基因在心脏、肝胰腺、鳃、肠、性腺、眼柄、肌肉和腹神经等8种组织中均有表达,但在雌雄虾组织中的表达模式不同。HSP 60基因在雄性中的肝胰腺,心脏和性腺中表达最高,在雌性的性腺和心脏中表达最高;HSP 70基因在雄性和雌性的肝胰腺和性腺中表达最高;HSP 90在雄性的性腺和肠中表达最高,在雌性中肝胰腺和性腺中表达最高;CuZnSOD基因在雄性肝胰腺、肠中表达最高,在雌性眼柄、肠中表达最高。(4)用溶藻弧菌、副溶血弧菌和嗜水气单胞菌分别胁迫红螯螯虾,采集胁迫后3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、48 h虾的鳃组织,提取总RNA反转录为cDNA后进行荧光定量PCR,结果表明溶藻弧菌胁迫后,HSP 60在12h时的表达量最高,HSP 70在9 h时的表达量最高,HSP 90则在6 h时表达量最高,CuZnSOD在3 h时死亡虾的鳃中表达量最高,在24 h时存活虾的鳃中表达量最高;副溶血弧菌侵染后,HSP 60在9 h时表达量最高,HSP 70在12 h时表达最高,HSP 90在3 h时存活虾的鳃中表达量最高,在9 h时死亡虾的鳃中表达量最高,CuZnSOD在6 h时表达量最高;嗜水气单胞菌侵染后,HSP 60、HSP 70、HSP 90均在24 h时表达量最高,CuZnSOD则在3 h时死亡虾的鳃中表达量最高,在6 h时存活虾的鳃中表达量最高。QRT-PCR结果暗示HSP基因与CuZnSOD基因都参与了红螯螯虾应对致病微生物的胁迫反应,并在红螯螯虾的免疫应答中起着重要作用。总之,本研究完成了红螯螯虾全长转录组测序,丰富和补充了红螯螯虾转录本信息。克隆了红螯螯虾3种不同的HSP基因HSP 60、HSP 70、HSP 90和CuZnSOD基因,通过荧光定量PCR分析了它们在不同组织和在受不同细菌侵染后的表达变化情况,本实验只是克隆和初步的研究了红螯螯虾HSPs基因和CuZnSOD基因的表达情况,对于其具体的功能还有待于应用RNAi和过表达等技术更深一步地研究。
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