研究背景FYVE,Rho GEF And PH Domain Containing 1（Fgd1）是位于X染色体的Xp11.12区域的一个基因,该基因是一个发育的关键基因,它的突变会导致一种被称为阿斯科格综合征（Aarskog-Skott syndrome,AAS）的疾病,这种疾病会导致患者的面部、生殖器形态发生异常。FGD1蛋白属于鸟苷酸交换因子（GMP Exchange Factor,GEF）,目前研究发现FGD1可以特异性活化Cdc42蛋白参与多种生命进程,特别在调控细胞外基质（Extracellular Matrix,ECM）重塑、提高细胞内的物质转运方面具有关键作用。近年来,越来越多研究揭示了GEF家族蛋白在肿瘤发生发展中具有关键的作用,可作为治疗肿瘤的潜在药物作用靶点。目前,研究已经证实Fgd1在多种肿瘤中存在突变和异常高水平的表达。这表明,Fgd1基因与肿瘤的发生或发展具有异常密切的关联。但目前仅有极少量文章报道了Fgd1基因在肿瘤中的作用。在肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）中的发生发展过程中,ECM重塑在HCC前期的肝硬化阶段以及HCC的转移阶段均起重要作用。可是作为ECM的调控核心,Fgd1在HCC中的作用尚未见报道。实验目的研究FGD1在HCC中的作用,探究其作为HCC预后分子标记以及药物作用靶标的可能。实验方法本研究下载了TCGA数据库中373例肝癌标本和50例对应癌旁组织样本RNA-seq数据以及对应临床资料,利用统计学的方法分析了肝癌中Fgd1的表达高低与临床预后的关系,并比对了肝癌和对应癌旁中Fgd1的表达差异,用以探究Fgd1表达情况与病人预后的关系,观察其是否能够作为HCC患者预后评价的生物标志物。随后,通过分子生物学的方法分别构建了Fgd1敲低与过表达的HCC细胞系,并研究Fgd1敲低和过表达后对HCC细胞增殖、凋亡、侵袭和转移的影响。为了研究体内Fgd1对肿瘤生长的作用,本研究进行了裸鼠皮下成瘤实验并动态观察了Fgd1敲低后对肿瘤生长的影响。本实验还通过利用蛋白组学技术i TRAQ,深入分析Fgd1参与HCC进展的下游作用蛋白及其相关分子通路。最后利用电镜技术、Western Blot技术以及免疫荧光技术等进一步验证Fgd1是否通过相关分子通路参与HCC的进程。实验结果TCGA数据结果显示,肝癌组织中Fgd1表达要显著高于癌旁组织,约为3.64倍,且Fgd1表达低组的患者生存期要明显好于Fgd1表达高的患者。通过进一步分析肝癌细胞系中Fgd1的表达,本研究构建了低表达Fgd1的Bel-7404细胞系和过表达Fgd1的Hep3B细胞系,以研究Fgd1在HCC中的作用,结果显示,敲低Fgd1后Bel-7404细胞系的增殖能力减弱,增殖标志物Proliferating Cell Nuclear Antigen（PCNA）的表达减少,Caspase3/7的活性提高,提示凋亡增加,且侵袭和转移能力减弱;而过表达Fgd1的Hep3B细胞系的结果却恰好相反,过表达Fgd1后Hep3B细胞增殖能力明显提高,Caspase3/7的活性减弱,细胞凋亡减少,且侵袭转移的能力增加,这两个实验一致说明Fgd1能够促进HCC的发展。为了进一步研究FGD1在体内对HCC的作用,本研究通过裸鼠皮下成瘤实验,进一步探讨了Fgd1在体内的作用。实验结果显示,敲低Fgd1的Bel-7404细胞系在裸鼠体内能显著的抑制肿瘤的生长速度,这更好的说明了Fgd1在肿瘤中的作用。随后,为了进一步了解FGD1的作用机制,本研究通过i TRAQ蛋白组学技术筛查了在Fgd1敲低后Bel-7404中蛋白组学的变化,通过比对两组Fgd1的Bel-7404细胞系中表达差异的蛋白,发现一共有64个蛋白发生了显著变化,通过Western Blot技术,我们确认了这些蛋白的表达差异,并对这些蛋白进行了聚类,聚类结果显示,Fgd1可能在能量代谢以及内质网功能上具有重要作用,更重要的是,研究数据显示Fgd1可能与自噬存在密切的关联。为了进一步明确其中的关联,本研究通过利用电镜和Western Blot技术明确Fgd1能够通过Cdc42通路影响自噬,从而参与肿瘤的发生发展。结论Fgd1的表达与HCC患者的预后密切相关,其在HCC中过表达可以促进细胞的增殖、侵袭和迁移并抵御凋亡。敲低Fgd1的表达会导致HCC细胞侵袭性伪足结构异常,影响HCC的上皮间质转化相关进展。不仅如此,Fgd1表达下降还会引起ATP含量降低。最后,我们还发现Fgd1能够通过Cdc42通路影响HCC的自噬从而参与HCC的相关进展。