电化学免疫分析法将免疫反应的特异性和电化学的便捷性相结合,因其具有选择性好、灵敏度高、分析费用低等特点,逐步成微量、痕量分析中普遍使用的一种检测方法。目前,在材料科学和生化技术的快速进步同时,纳米复合材料的应用为发展新型灵敏的电化学免疫分析体系提供了新的研究方向。基于纳米复合材料的电化学生物传感器,不仅提高了其检测性能,而且使其化学、物理性质以及检测灵敏度和检测耗时都得到了有效改进。发展乳制品中大肠杆菌的快速、灵敏、准确的检测方法对乳制品质量的保证、乳品工业的发展、人民健康的保障都具有重大的现实意义。基于不同类型的纳米复合材料本文发展了三种电化学传感器并将其用于实际样品检测。由于本方法具有优良的电化学测定特性,这为改进不同形态乳制品中大肠杆菌的分析研究提供了理论支持。具体内容如下:1.金纳米棒标记物放大的电化学免疫分析乳制品中大肠杆菌的研究本实验合成了二氧化硅包金纳米棒(AuNR@SiO2)的多组分纳米材料,并以其结合抗体和二茂铁甲酸(FCA)制备生物功能化的探针{dAb-Au NR-FCA}用于乳制品中大肠杆菌(E.coli)的快速检测。{dAb-AuNR-FCA}利用dAb免疫结合大肠杆菌,FCA作为电活性物质将免疫反应转化为电流信号。采用“三明治”免疫分析策略,基于示差脉冲伏安(Differential Pulse Voltammetry)法电化学检测FCA产生的DPV响应电流与菌体数量之间的关系,对大肠杆菌的进行定量。由于可以在AuNRs@SiO2上固定更多的FCA和抗体,从而对信号进行放大,使得检测灵敏度有了很大的提高。实验结果表明,FCA产生的电流信号与大肠杆菌浓度的对数在1.0×102~5.0×104 cfu/mL范围内呈良好的线性关系,检出限达到60 cfu/mL(S/N=3)。利用该电化学免疫分析法对乳制品进行了大肠杆菌的加标回收实验,回收率在95.6%~106%之间。2.基于酶诱导沉积聚苯胺的信号放大策略用于电化学免疫分析乳制品中大肠杆菌基于辣根过氧化酶(HRP)催化氧化苯胺生成聚苯胺(PAn),建立信号放大的电化学免疫分析方法用于乳品中E.coli的检测。研制了树枝状大分子包裹纳米金复合材料(PAMAM(Au))并将其用于构建生物传感界面。文中重点研究了在纳米复合材料制备过程中HAuCl4/PAMAM不同比率对传感器灵敏度的影响。同时,将大肠杆菌检测抗体(dAb)和HRP共同修饰于多壁碳纳米管(CNTs)表面制备了{dAb-CNT-HRP}生物复合物。采用“三明治”夹心方式,基于大肠杆菌表面抗原与其抗体之间的相互作用,将{dAb-CNT-HRP}吸附于电极表面。利用不同浓度的大肠杆菌对应产生不同量的PAn,最后检测时获得大小不同的电信号,实现了对大肠杆菌的检测。结果表明,浓度范围在1.0×102~1.0×106 cfu/mL区间,示差脉冲伏安响应电流信号与E.coli浓度的对数呈良好线性关系,检出限为50cfu/mL。利用该电化学免疫分析方法对不同乳制品进行了大肠杆菌的加标回收实验,回收率在96.8%~108.7%之间。3.基于树枝状大分子和功能化纳米金的电化学免疫传感器用于乳制品中大肠杆菌检测利用壳聚糖-硫堇修饰玻碳电极为基底,通过酰胺键固定树枝状大分子包裹纳米金复合材料(PAMAM(Au))进而结合大肠杆菌单克隆抗体。另外,采用纳米金为载体固定辣根过氧化酶(HRP)和检测抗体(dAb)制备了{dAb-AuNPs-HRP}生物复合物。以乳制品中大肠杆菌为研究对象,利用大肠杆菌与其抗体之间的特异性结合构建“三明治”结构。采用电极表面固定的硫堇为电子媒介体,通过测定HRP催化过氧化氢产生的响应电流实现对乳制品中大肠杆菌的检测。实验表明:在2.0×102~2.0×106 cfu/mL浓度范围内,电流信号与大肠杆菌浓度的对数呈线性关系,检出限为80 cfu/mL。本文所研制的电化学免疫传感器具有灵敏度高、选择性好、响应信号快等优点,为乳制品中大肠杆菌的检测提供了新的方法。