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第一部分:Nrf2通过抑制M1型巨噬细胞极化减轻肾脏草酸钙结晶沉积及肾小管上皮细胞损伤的作用研究目的:巨噬细胞是重要的固有免疫细胞,影响着草酸钙肾结石的发生发展,其中M1型和M2型巨噬细胞分别具有促进和抑制草酸钙结晶沉积的作用。本部分研究拟从体内外水平探讨Nrf2的药物激动剂萝卜硫素（Sulforaphane,SFN）能否通过激活Nrf2,抑制M1型巨噬细胞极化,减轻肾脏草酸钙结晶沉积及肾小管上皮细胞的炎症损伤。方法:在动物实验中,C57BL/6J小鼠预先给予不同剂量的SFN腹腔注射,并通过乙醛酸腹腔注射建立小鼠草酸钙结晶沉积模型。利用偏光显微镜和Pizzolato染色检测各组小鼠肾脏草酸钙结晶沉积情况;通过PAS染色和TUNEL染色评估各组小鼠肾脏肾小管的损伤程度及肾脏细胞的坏死情况;分析基因综合表达数据库中的一组Nrf2基因敲除小鼠骨髓来源的巨噬细胞的全基因组基因表达谱的差异表达基因,并利用免疫组化和qRT-PCR进行验证;利用组织免疫荧光和免疫组化评估小鼠肾脏组织中巨噬细胞的极化状态。在细胞实验中,分别使用不同浓度的SFN,Nrf2过表达质粒或干扰RNA处理与草酸钙晶体刺激的肾小管上皮细胞共培养的小鼠骨髓来源的巨噬细胞,利用qRT-PCR和Western Blot分析各组巨噬细胞的极化标志物及相关蛋白的表达情况;采用细胞免疫荧光染色和流式细胞术来检测巨噬细胞极化亚型。结果:偏光显微镜和Pizzolato染色显示,随着SFN剂量增加,小鼠肾脏草酸钙结晶沉积显著减少;PAS染色和TUNEL染色发现,SFN干预组小鼠肾小管损伤程度明显减轻,坏死细胞明显减少,且减轻程度与SFN的剂量呈正相关;对基因综合表达数据库的数据集（GSE71695）的分析提示,Nrf2敲除后M1型巨噬细胞极化因子TLR4和IRF1,巨噬细胞标志基因NOS2及细胞因子相关基因IL-1b显著上调;免疫组化和qRT-PCR显示,Nrf2的表达与TLR4和IRF1表达均呈现负相关;组织免疫荧光和免疫组化表明,SFN干预组小鼠M1型巨噬细胞标志物iNOS表达逐渐降低,M2型巨噬细胞标志物ARG-1表达逐渐升高;qRT-PCR和Western Blot分析,发现SFN处理或过表达Nrf2后,Nrf2的表达出现上调,TLR4和IRF1的表达下调,与此同时,iNOS也出现下调,而ARG-1的表达则出现升高;而干扰Nrf2后,则出现相反的效应。细胞免疫荧光染色发现,SFN处理或过表达Nrf2后,巨噬细胞表达更多的ARG-1,表达更少的iNOS;而干扰Nrf2后,则出现相反的效应。流式细胞术显示,SFN处理或过表达Nrf2后,巨噬细胞表达更多的M2型巨噬细胞标志物CD206,表达更少的M1型巨噬细胞标志物CD11c;而干扰Nrf2后,则出现相反的效应。结论:SFN通过上调Nrf2的表达和功能,抑制M1型巨噬细胞极化,促进M2型巨噬细胞极化,进而减轻肾脏草酸钙结晶沉积及肾小管上皮细胞的炎症损伤,最终抑制草酸钙肾结石发生发展。第二部分:Nrf2通过Nrf2-miR-93-TLR4/IRF1轴抑制M1型巨噬细胞极化减轻草酸钙晶体诱导的肾脏炎症损伤及结晶沉积的机制研究目的:第一部分研究证实了SFN通过激活Nrf2,抑制M1型巨噬细胞极化,进而减轻肾脏草酸钙结晶沉积及肾小管上皮细胞的炎症损伤的作用。本部分研究拟进一步探讨Nrf2激活后抑制M1型巨噬细胞极化的潜在分子机制。方法:通过分析巨噬细胞的miRNA表达谱,寻找既可以被Nrf2转录激活,又可以同时靶向抑制TLR4和IRF1的miRNA。染色质免疫共沉淀实验检测Nrf2能否结合到miR-93-5p的启动子区。双荧光素酶实验、qRT-PCR和Western Blot明确miR-93-5p对TLR4和IRF1的调控作用及miR-93-5p对巨噬细胞极化的影响。用SFN和（或）miR-93-5p inhibitor处理与草酸钙晶体刺激的肾小管上皮细胞共培养的小鼠骨髓来源的巨噬细胞,细胞免疫荧光和流式细胞术检测巨噬细胞的极化亚型;荧光显微镜检测巨噬细胞对晶体的吞噬能力;流式细胞术检测肾小管上皮细胞的坏死情况;ELISA检测培养基中的炎性细胞因子的水平。在小鼠草酸钙结晶沉积模型的基础上,给予小鼠SFN腹腔注射和（或）miR-93-5p的长效抑制剂AntagomiR-93尾静脉注射,偏光显微镜和Pizzolato染色检测小鼠肾脏草酸钙结晶沉积情况;PAS染色和TUNEL染色评估小鼠肾脏肾小管的损伤程度及肾脏细胞的坏死情况;micro PET-CT和ELISA评估小鼠肾脏的炎症反应;组织免疫荧光和免疫组化评估小鼠肾脏中巨噬细胞的极化状态。结果:miR-93-5p既可以被Nrf2转录激活,又可以同时靶向抑制TLR4和IRF1。染色质免疫共沉淀提示,Nrf2可以和miR-93-5p的启动子区直接结合。双荧光素酶实验发现,miR-93-5p能够直接靶向TLR4和IRF1的3’UTR。qRT-PCR和Western Blot发现,SFN使Nrf2的表达出现上调,TLR4和IRF1的表达下调,M1型巨噬细胞减少,而M2型巨噬细胞增多,而miR-93-5p inhibitor则有相反的效应;细胞免疫荧光和流式细胞术显示,SFN使M1型巨噬细胞减少,而M2型巨噬细胞增多,而miR-93-5p inhibitor则有相反的效应;荧光显微镜发现,SFN使巨噬细胞的吞噬能力增强,而miR-93-5p inhibitor则有相反的效应;流式细胞术显示,SFN使肾小管上皮细胞坏死比率减少,而miR-93-5p inhibitor则有相反的效应;ELISA显示,SFN使促炎细胞因子减少,抗炎细胞因子增多,而miR-93-5p inhibitor则有相反的效应。偏光显微镜和Pizzolato染色提示,SFN可减少乙醛酸诱导的小鼠肾脏草酸钙晶体沉积,而AntagomiR-93则有相反的效果;PAS染色和TUNEL染色发现,SFN可减轻肾小管损伤程度,而AntagomiR-93则有相反的效果;micro PET-CT及ELISA表明,SFN可减轻草酸钙晶体诱导的肾脏炎症反应,而AntagomiR-93则有相反的效果;组织免疫荧光和免疫组化表明,SFN可减少小鼠肾脏M1型巨噬细胞,增加M2型巨噬细胞,而AntagomiR-93则有相反的效果。结论:SFN激活Nrf2,通过Nrf2-miR-93-TLR4/IRF1轴,抑制巨噬细胞向M1极化,从而减轻肾小管上皮细胞的炎症损伤,并促进巨噬细胞对草酸钙结晶的吞噬,进而减轻肾脏草酸钙结晶沉积,最终抑制草酸钙肾结石的发生发展。