【摘 要】
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非洲猪瘟（ASF）是一种引起家猪和野猪高致命性、高传染性和高死亡率的传染病,目前无安全有效的疫苗。非洲猪瘟病毒（ASFV）编码150-200种蛋白,包括50多种结构蛋白,100多种非结构蛋白,但大部分蛋白功能未知。本研究拟构建ASFV I9R、B125R、F317L重组蛋白,分析其反应原性和免疫表型,以期为ASFV蛋白功能的研究及疫苗研究奠定初步基础。本研究首先使用生物信息技术分析ASFV蛋白I9
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非洲猪瘟（ASF）是一种引起家猪和野猪高致命性、高传染性和高死亡率的传染病,目前无安全有效的疫苗。非洲猪瘟病毒（ASFV）编码150-200种蛋白,包括50多种结构蛋白,100多种非结构蛋白,但大部分蛋白功能未知。本研究拟构建ASFV I9R、B125R、F317L重组蛋白,分析其反应原性和免疫表型,以期为ASFV蛋白功能的研究及疫苗研究奠定初步基础。本研究首先使用生物信息技术分析ASFV蛋白I9R、B125R、F317L的理化性质、B细胞抗原表位、蛋白质的二级和三级结构预测其免疫原性;其次通过构建原核表达载体p ET28a-His-I9R、p ET28a-His-F317L、p ET28a-His-B125R,分别进行诱导表达纯化,并将纯化的蛋白分别进行抗原包被,与ASFV的阳性血清反应,采用ELISA方法评估其反应原性。最后构建p CMV-Flag-I9R、p CMV-FlagF317L、p CMV-Flag-B125R真核表达载体,分别转染至293T细胞中,通过荧光定量PCR检测免疫因子的特点进而分析其免疫表型。生物信息学结果显示ASFV蛋白F317L蛋白具有较强的免疫原性,其次是B125R蛋白和I9R蛋白。PCR测序和Western Blot结果表明成功构建了p ET28a-His-I9R、p ET28a-His-F317L和p ET28a-His-B125R重组载体,并成功表达了ASFV I9R、B125R和F317L重组蛋白,纯化后的重组蛋白与ASFV阳性血清反应的ELISA实验结果显示,ASFV I9R、B125R和F317L重组蛋白与ASFV阳性血清反应的P/N值分别为1.715、1.813和2.449。表明ASFV I9R、B125R和F317L蛋白均与ASFV阳性血清具有很好的反应原性,其中F317L蛋白的反应原性好于B125R蛋白和I9R蛋白。此外,细胞转染实验分析结果显示,与空白对照相比,I9R重组蛋白转染293T细胞后,细胞中m TOR、Bcl2基因的转录水平差异极显著（P＜0.01）,Bid和IFN-α基因的转录水平差异显著（P＜0.05）,而Gsd md、Beclin-1和Caspase-3基因的转录水平均低于空白对照组;F317L可导致293T细胞中m TOR基因的转录水平升高,与对照组相比差异极显著（P＜0.01）;其次是IFN-α和Bcl2基因,差异显著（P＜0.05）,Gsdmd、Beclin-1和Caspase-3基因的转录水平均低于空白对照组;对于B125R,可以引起细胞中m TOR和Bid转录水平升高,与空白对照组相比差异极显著（P＜0.01）,而IFN-α、Gsdmd、Becli n-1和Caspase-3基因的转录水平均低于空白对照组。免疫表型实验结果表明ASFV I9R、B125R和F317L重组蛋白与细胞自噬和细胞凋亡的免疫表型具有一定的相关性。综上,本研究成功构建了ASFV I9R、B125R和F317L重组蛋白。其中ASFV F317L具有较强免疫原性,其次是B125R和I9R;此外,F317L与ASFV阳性血清具有较强的反应原性,B125R和I9R的反应原性较弱。三个重组蛋白均能够在转录水平上调293T细胞的自噬和细胞凋亡表型,表明ASFV I9R、B125R和F317L重组蛋白与细胞自噬和细胞凋亡的免疫表型具有一定的相关性。本研究初步分析了ASFV I9R、B125R和F317L蛋白的免疫表型,为ASFV蛋白功能和疫苗的研究奠定了理论基础,这对ASFV致病机制和防控的研究具有指导意义。
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