论文部分内容阅读
棉花是重要的经济作物和油料作物,是纺织原料的主要来源,具有相对较强的抗逆性,然而环境问题日益突出,土地盐碱化、水资源匮乏逐渐成为制约棉花产量、影响棉花品质的重要因素。因此,培育抗旱、耐旱的棉花品种对农业生产具有重要意义。Expansin是一种能促进细胞壁膨胀的蛋白家族,包括α-expansin、β-expansin、expansin-like A和expansin-like B四个亚家族。近年来关于expansin参与植物逆境响应的研究逐渐增多,但其作用机制仍不清楚。本研究基于前期棉花原生质体再生细胞壁抑制差减文库中分离到一个expansin-like基因GhEXLB2,对其在棉花中的抗旱功能进行初步鉴定和机制探索,主要结果如下:序列同源比对分析发现GhEXLB2与可可Tc EXLB1最同源,相似度为92%,并且具有expansin蛋白典型的两个结构域;启动子顺式作用元件预测发现GhEXLB2上游启动子含有较多的逆境响应、伤口诱导、脱水诱导和激素响应元件;逆境和激素诱导表达分析表明GhEXLB2受PEG和NaCl等逆境因子诱导上调表达,表明其可能参与棉花抗非生物逆境过程。本研究前期已获得GhEXLB2超量表达和RNAi干涉表达材料,通过加代获得转基因纯系材料。我们对这些转基因系进行萌发期、苗期和成株期干旱处理,萌发期用PEG6000渗透处理模拟干旱处理发现,GhEXLB2超表达系的主根长和下胚轴长显著高于对照和干涉系,而H2O2含量显著低于干涉系;幼苗期通过PEG6000处理,发现超表达系萎蔫程度更轻,并且超表达系植株叶片中H2O2含量显著低于对照和干涉系,而MDA含量略低于对照和干涉系;成株期通过断水处理后,转基因株系的萎蔫程度没有明显差异,但复水后,超表达系植株能更快地恢复生长。因此,通过萌发期、苗期及成株期抗旱性鉴定发现,在棉花中超表达GhEXLB2能够增强棉花的抗旱性。我们对成株期干旱处理8天(土壤相对含水量在16%-19%之间)的GhEXLB2转基因株系和对照株系的倒一叶叶片取样进行RNA-seq测序,以正常浇水的材料作为对照。通过比对组之间的比对筛选,共筛选到316个差异表达基因,将这些差异表达基因进行GO聚类分析,发现这些差异基因在细胞组成、生物学进程和分子功能上主要富集在与微管和细胞骨架相关的生物进程和功能上。处理组中tubulin基因的热图分析表明,大部分tubulin在超表达材料中上调表达,而在干涉材料中下调表达,表明GhEXLB2上调表达能够增强大多数tubulin基因的转录表达水平。从这些差异基因中挑选出表达差异极显著的可能与抗旱相关的基因进行RT-PCR检测,验证结果基本与RNA-seq测序结果吻合,尤其是微管蛋白基因α-tubulin(Gh_D02G1393)、ACC氧化酶基因(Gh_A07G0773)和AP/ERF转录因子基因(Gh_D07G0442)在正常浇水情况下不同材料中的表达量无明显差异,但在干旱处理的不同材料中,这些基因在超表达株系中的表达量显著高于对照和干涉系。同时,我们以GhEXLB2蛋白为诱饵通过酵母双杂交筛选棉花非生物逆境文库,共筛选到19个与GhEXLB2蛋白互作的蛋白,点对点验证发现其中有7个能与GhEXLB2蛋白互作激活报告基因表达,包括丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Gh_D06G225)、WD40重复家族蛋白(Gh_A01G0493)、泛素(Gh_D01G0586)、NF-YB超家族蛋白(Gh_D13G1387)、核糖-5-磷酸异构酶(Gh_D07G2027)、E2泛素缀合酶(Gh_D11G0132)以及谷氧还蛋白(Gh_A10G0874)。其中编码WD40重复家族蛋白、泛素蛋白、核糖-5-磷酸异构酶、谷氧还蛋白的基因在RNA-Seq表达谱里面也差异表达。