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华南地区严重危害入侵植物五爪金龙(Ipomoea cairica),旋花科(Convolvulaceae)多年生草质藤本杂草,原产北美,现广泛分布于热带亚热带地区,近年来在华南地区蔓延并造成严重危害。目前对外来入侵植物五爪金龙的研究主要集中在其入侵的生物学特征、生理生态特征以及化感作用等方面,而对其入侵性的分子机制缺乏了解。植物的生长发育是受细胞周期活动调控的,CycD是G1特异的细胞周期蛋白,控制细胞周期通过G1期进入S期,CycD3在G1/S期转换中起关键调控作用。本课题拟从生理和分子水平深入研究外来入侵植物五爪金龙的环境适应性机制。
本研究从外来入侵植物五爪金龙成功克隆出细胞周期蛋白CycD3基因,并分析该基因在温度和干旱胁迫诱导下的表达变化,结合五爪金龙部分生理指标测定结果的分析,探讨了五爪金龙对不同环境因子下的分子响应机制；应用新一代高通量测序Illumina HiSeqTM2000技术对五爪金龙及其近缘本地种七爪金龙进行转录组测序和功能分析,得到了两个物种大量的转录本信息,为研究五爪金龙入侵性的分子机理奠定基础。主要研究结果如下:
根据旋花科番薯属番薯(Ipomoea batatas)CycD3的序列(NCBI号:AB478417)的保守区域设计特异性引物,用RT-PCR结合RACE以及巢式PCR的方法,从五爪金龙茎尖中克隆出IcCycD3基因。对该基因序列及其编码氨基酸序列进行生物信息学分析表明,IcCycD3基因全长1366bp,具有1092bp完整的开放读码框(ORF),编码363个氨基酸。预测蛋白的推测pI值是5.25,分子量为41.6kDa。推演蛋白质具有植物Cyclin基因的关键特征,在近N端含有一个LXCXE模体的短序列,还包含Cyclin box保守结构域。
分析不同温度处理和干旱胁迫下五爪金龙叶片的相对含水量、质膜相对透性、叶绿素含量、PSⅡ最大光化学效率Fv/Fm变化以及IcCycD3基因表达变化。结果表明随着温度的降低,叶片质膜相对透性增加,叶绿素含量降低,Fv/Fm的比值下降,恢复到室温时各项生理指标没有明显的恢复。干旱胁迫处理的第4天叶片质膜相对透性增加、叶绿素含量降低、Fv/Fm的比值降低,第6天相对含水量大幅降低,复水两天后生理指标均有恢复。这表明低温胁迫相对干旱胁迫对五爪金龙造成的伤害更严重。通过RT-PCR检测IcCycD3基因表达量,无论是干旱胁迫还是低温胁迫处理下,IcCycD3基因表达变化与生理响应一致。
将目的片段与植物表达载体pBEGFP构建重组质粒pBEGFP-IcCycD3,用农杆菌侵染拟南芥花絮的方法转化拟南芥,PCR检测结果表明,IcCycD3基因插入了拟南芥基因组中并且得到了表达。
应用Illumina HiSeqTM2000测序技术分别对五爪金龙和七爪金龙进行转录组测序和基因功能注释及分析,五爪金龙测序获得90329个Unigene,七爪金龙测序获得86946个Unigene。筛选出63669个差异表达的Unigene,将差异表达基因进行Pathway分析,两者存在125条差异表达途径。在总的Unigene中发现与细胞周期蛋白CycD3相关基因有6个。五爪金龙基因表达相对七爪金龙上调的基因有2个,下调的基因有3个。由此推测CycD3通过调节细胞周期来影响入侵植物生长速度。