心肌缺血再灌注损伤(Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury,MIRI)是指心脏在缺血基础上恢复血流后损伤反而加重,甚至发生不可逆性损伤的现象。常见于外科溶栓治疗、体外循环、冠状动脉搭桥术、血管成形术、瓣膜置换术等,再灌注后缺血的心肌出现舒缩功能降低、心肌能量代谢障碍、心律失常、心肌细胞超微结构的变化及冠脉无复流等现象。目前公认的MIRI的病理机制主要包括:氧化应激损伤、细胞内钙超载、细胞能量丧失、细胞凋亡、中性粒细胞炎症反应激活等。钙离子是一种细胞内源性第二信使,细胞内钙稳态在维持和调节细胞正常生理功能方面起重要作用。钙超载在心肌缺血时已经开始,但在再灌注期间细胞内、肌浆网及线粒体内的钙超载会逐渐加重,进而引起肌浆网损伤及线粒体电荷重新分布,随后引起线粒体膜通透性转换孔(mPTP)的开放,mPTP的开放进一步引起线粒体膜去极化、线粒体膨胀、细胞色素C的释放,这是心肌细胞走向不可逆性死亡的重要步骤。胞内钙离子的增加也会引起细胞内酶的激活(如细胞凋亡蛋白酶、钙蛋白酶、磷脂酶、核酸内切酶及蛋白酶等),蛋白酶和磷脂分解作用会导致胞内的自身消化。因此,心肌细胞内钙超载可能是启动其缺血再灌注所导致的心肌细胞损伤的关键因素之一,降低再灌注期间细胞内Ca2+超载对保护MIRI受损心肌至关重要。减轻再灌注时胞内钙超载对缓解MIRI有至关重要的作用。虽然钠钙交换器的逆向转运(Na+-Ca2+Exchanger,NCX)和L型钙通道是介导I/R时心肌细胞“外钙内流”的主要通道,采用胞膜电压门控通道钙离子通道抑制剂、线粒体钙离子单向转运体或钠-氢交换体的拮抗剂减轻钙超载可以减少50%的心肌梗死面积。然而相应的临床研究结果却远不如预期。经典瞬时受体电位(Canonical transient receptor potential,TRPC)通道是位于细胞膜上的一类重要的非选择性阳离子通道,选择性通透钠离子、钙离子。TRPC共有七个亚族成员,根据氨基酸序列的同源性差异,进一步分为TRPC1/2/4/5和TRPC3/6/7二个亚类,通道的激活与细胞功能密切相关,如细胞生长、收缩、增殖、运动、分泌、突触和感觉电位及基因表达。TRPC通道的表达及功能异常与多种疾病相关,TRPC3、TRPC4和TRPC6在心肌肥大、心衰的发生方面的作用及机制探讨已相当深入。到目前为止,由α 1AR-Gq-PLC通路激活而引起的、通过TRPC通道的钙内流在MIRI钙超载及心肌细胞凋亡中的作用还未见报道。本研究利用TRPC3/6/7基因敲除鼠为实验对象制备I/R模型,从离体和在体两个方面,系统地探讨TRPC3和TRPC6在心肌缺血再灌注损伤过程中所起的作用,结果表明:TRPC3、TRPC6基因敲除可降低转录因子NFATc3的水平,降低再灌时的钙超载,引起p-AKT、p-ERK1/2的上调,进而减小缺血再灌注时的梗死面积,降低心肌细胞凋亡率。1.TRPC通道抑制剂SKF96365抑制H9C2心肌细胞H/R时的凋亡为观察H9C2细胞在缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)时SKF96365对心肌细胞凋亡的影响,首先应用钙影像技术研究H9C2心肌细胞及原代心肌细胞在SERCA泵抑制剂CPA诱导下的钙内流变化,结果显示:TRPC通道抑制剂SKF96365,TRPC3通道特异性抑制剂Pyr3均可降低心肌细胞CPA引起的钙内流,但SKF96365下降的更明显。利用H9C2细胞体外H/R实验模拟在体心肌缺血再灌注损伤,在复氧时加入TRPC通道抑制剂以探讨其在心肌缺血再灌注损伤中的作用,结果显示:复氧时加入SKF96365后,BAX/1BCL2比值显著下降。为进一步探讨TRPC通道在H/R时对线粒体膜电位的影响,采用JC-1荧光探针检测IH/R时线粒体膜电位的变化,复氧时依次加入不同浓度梯度的SKF96365,结果显示在0-25uM范围内,随着SKF96365浓度升高,线粒体膜电位也逐部恢复,由此提示TRPC通道可以增强H/R过程中的钙内流、降低线粒体膜电位而促进凋亡。2.TRPC3/6在I/R过程中表达上调为明确TRPC3、6在MIRI过程中是否发挥作用,对I/R小鼠及假手术小鼠的TRPC3/6进行检测。RT-PCR检测显示:TRPC1、2、3、4、6在mRNA水平均有表达,TRPC3的表达较强,而TRPC6的表达较弱,TRPC5、7无表达,免疫组化技术检测显示原代小鼠心肌细胞TRPC3、6均有表达、TRPC7则无表达。免疫印迹技术检测显示I/R后TRPC3、TRPC6明显增加,CaNα、CaNβ、NFATc3的蛋白表达均明显升高。钙影像检测显示H9C2细胞在缺氧9小时复氧6小时后,OAG可通过TRPC3/6引起钙内流增加。以上结果提示,I/R时,TRPC3/TRPC6明显增加,钙内流增加,Ca2+-Calcineurin-NFAT信号通路活性上调。3.TRPC3/6/7基因敲除改善心肌缺血再灌注损伤I/R时,TRPC3/TRPC6明显增加,钙内流增加,Ca2+-Calcineurin-NFAT信号通路活性上调。为明确TRPC3/6/7基因敲除对MIRI的影响,首先采用Evans-Blue/TTC染色法检测小鼠心肌梗死面积(IS),结果显示,TRPC3/6/7+小鼠I/R后IS明显下降。I/R模型后的心脏病变区域TUNEL染色进一步证实,TRPC3/6/7+小鼠I/R后心肌细胞凋亡率下降。为进一步明确TRPC3/6/7+基因敲除小鼠心肌细胞SOCE的特性,分离纯化TRPC3/6/+及WT乳鼠心肌细胞,钙影像技术检测用CPA诱导下的SOCE变化,结果显示:TRPC3/6/7+乳鼠心肌细胞SOCE明显小于WT乳鼠心肌细胞。为明确TRPC3/6/7基因敲除降低I/R心肌梗死面积,降低凋亡率的分子机制,采用免疫印迹技术对I/R后心肌组织 CaNα、CaNβ、NFATc3、BAX、BCL2、Caspase 3、p-AKT、p-ERK1/2 等的蛋白表达水平进行检测,结果显示:TRPC3/6/7基因敲除后,CaNα、CaNβ、NFATc3、BAX、Cleaved Caspase3的蛋白表达水平降低,p-AKT、p-ERK1/2表达水平明显上升。这些结果提示TRPC3/6/7基因敲除可改善MIRI。本研究结果表明,I/R 过程中,TRPC3、6 通过 TRPC3、6-Ca2+-Calcineurin-NFAT 的正反馈环路,引起TRPC3、6的表达水平升高,钙内流增加,加重心肌细胞内质网和线粒体钙超载。而TRPC3/6/7基因敲除则可下调Ca2+-Calcineurin-NFAT通路的活性,减轻心肌细胞内钙离子超载,上调p-AKT、p-ERK1/2的表达水平,从而达到降低缺血再灌注损伤的心肌梗死面积,降低心肌细胞凋亡率的目的。因此,本研究为MIRI的发病机制及临床治疗提供了新的实验依据。