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传染性胰脏坏死病（Infectious pancreatic necrosis,IPN）是由传染性胰脏坏死病毒（Infectious pancreatic necrosis virus,IPNV）引起的高致病性、高死亡率的病毒性疾病,主要感染鲑鳟鱼的鱼苗和稚鱼,广泛流行于欧洲、亚洲的很多国家,是各国进出口鱼卵鱼种的重要检疫对象。细胞自噬在病原微生物感染过程中具有双重作用,有的病原微生物可通过诱导自噬促进自身的增殖,有的病原微生物的增殖却被细胞自噬所抑制。为了探究IPNV和自噬在宿主细胞大马哈鱼胚胎细胞（Chinook salmon embryo cells,CHSE-214）中的相互作用关系,本研究首先用自噬诱导剂Rapamycin（100n M、500 n M、1000 n M）、自噬抑制剂3-MA（1 m M、5 m M、10 m M）或者PBS处理CHSE-214细胞,以PBS处理的细胞作为阴性对照,孵育72小时后收集样品,利用MTT法筛选合适浓度的Rapamycin、3-MA,排除化学药物毒性对实验准确性的影响;之后本研究通过透射电镜、间接免疫荧光、Western blotting三种经典检测自噬的方法探究IPNV感染CHSE-214细胞是否诱导自噬的产生。具体研究内容如下:首先用PBS、Rapamycin处理或者IPNV（MOI=0.1）感染CHSE-214细胞36 h后通过透射电子显微镜观察自噬体,其中PBS处理组作为阴性对照组;然后本研究将绿色荧光蛋白与LC3融合表达载体（p EGFP-LC3）转入宿主细胞24 h后,用PBS、Rapamycin处理或者IPNV（MOI=0.1）感染宿主细胞24 h后通过激光共聚焦检测技术观察LC3分子的点状荧光聚集,PBS处理组为阴性对照,Rapamycin处理组为阳性对照;用PBS或Rapamycin提前4 h预处理宿主细胞后感染MOI=0.1的IPNV,于感染后24 h、48 h收集不同处理组的细胞样品通过Western blotting检测LC3蛋白表型变化、p62的降解。之后本研究通过通过反转录实时荧光定量PCR（Reverse Transcription Quantitative Real-time PCR,RT-q PCR）、Western blotting、TCID50等方法检测了细胞自噬对IPNV的影响。用PBS、Rapamycin或者3-MA提前4 h预处理宿主细胞后接种MOI=0.1的IPNV,于感染后12 h、24 h、36 h、48 h、72 h收集不同处理组的细胞样品通过RT-q PCR、Western blotting、TCID50等方法检测IPNV在核酸水平、蛋白水平以及病毒滴度的变化,并且通过显微镜观察细胞病变情况。MTT检测结果显示Rapamycin处理组和1 m M、5 m M 3-MA处理组细胞存活率与PBS组相比无显著差异,10 m M 3-MA处理组细胞存活率显著低于PBS处理组（P<0.05）;因此,本研究采用500 n M Rapamycin和5 m M 3-MA用于后续实验。透射电子显微镜观察结果显示在Rapamycin处理组和IPNV处理组的细胞均可以看到典型的双层膜自噬体结构,而在阴性对照中未发现,说明IPNV感染诱导CHSE-214细胞自噬的产生。激光共聚焦显微镜观察结果显示在Rapamycin处理组和IPNV感染的细胞中可以观察到LC3分子的绿色荧光点状聚集,并且利用Image J软件对免疫荧光镜检视野（n=10）进行分析可知,Rapamycin处理和IPNV感染的细胞中的EGFP-LC3点状聚集水平差异不显著,并且显著高于PBS处理的细胞（P<0.05）,该结果进一步验证了IPNV感染诱导宿主细胞自噬的产生。Western blotting检测结果显示Rapamycin处理组和IPNV感染组的细胞可以观察到明显的LC3-I向LC3-II的转化,并且LC3-II/LC3-I、LC3-II/β-tubulin比率显著高于PBS对照组（P<0.05）;其中IPNV感染组细胞48 h的LC3-II/LC3-I、LC3-II/β-tubulin比率显著高于24 h（P<0.05）,均显著低于Rapamycin处理组（P<0.05）;在Rapamycin处理和IPNV感染的细胞中p62蛋白水平显著低于PBS对照组（P<0.05）;此外,IPNV感染组细胞48 h中p62蛋白水平显著低于24 h,均显著高于Rapamycin处理组（P<0.05）;Western blotting检测结果进一步证明了IPNV感染诱导CHSE-214细胞自噬的产生。病毒载量分析结果显示不同时间段收集的Rapamycin处理组细胞样品中VP1、VP2基因m RNA复制水平显著高于PBS处理组（P<0.05）;3-MA处理组细胞样品中VP1、VP2基因m RNA复制水平显著低于PBS处理组（P<0.05）;此外,在Western blotting结果中可以看到VP2蛋白水平具有相同的趋势;说明细胞自噬促进IPNV m RNA的复制,提高病毒的蛋白表达水平。病毒滴度结果显示,Rapamycin处理组在48 h、72 h的病毒滴度显著高于PBS处理组（P<0.05）,3-MA处理组病毒滴度显著低于PBS处理组（P<0.05）,说明细胞自噬可以提高IPNV的产量。显微镜结果显示在细胞处理60 h后,和没有任何处理的细胞相比,感染了IPNV的细胞均出现细胞病变现象;并且IPNV+Rapamycin处理组细胞病变程度明高IPNV+PBS处理组,IPNV+3-MA处理组细胞病变程度明显低于IPNV+PBS处理组,说明提高细胞自噬活性增加了出现病变的细胞数量,增加了病毒产量,此结果和滴度测定结果一致。综合上述结果,该研究证明了IPNV感染诱导CHSE-214细胞自噬的产生,并且自噬促进了IPNV在核酸和蛋白水平上的增殖,从而提高了IPNV的产量。该研究成果为探索IPNV致病机理提供了新的视角,为抗IPNV药物的研究提供新的方向。